Производные 1,4-бензодиазепина:диазепам

Основным вопросом аналитической токсикологии остается рассмотрение вопросов, связанных с подготовкой проб (объектов), включающих выделение (изолирование), очистку и концентрирование токсических соединений из разнообразных биологических обьектов, а также правильное изолирование для качественного и количественного определения возможностей различных методов анализа, их рациональное сочетание.
Методология проведения клинико-токсикологического анализа
С целью обнаружения и количественного определения диазепама для судебно-химического анализа изымают и направляют различные внутренние органы, кровь и мочу с учётом путей введения его в организм, распределения, путей и скорости выведения, длительности течения интоксикации и лечебных мероприятий.
Направляют рвотные массы, первые порции промывных вод, остатки лекарственных и химических веществ, напитков и другие объекты. При обнаружении в содержимом желудка крупинок, кристаллов, таблеток они также направляются на исследование.
Также извлекают и проверяют органы и ткани из трупа. Направляют целый комплекс внутренних органов: желудок с содержимым, 1 м тонкой кишки, 1/3 печени, 1 почку, всю мочу и не менее 200 мл крови.
При подозрении на внутримышечное введение – участок кожи или мышцы из области места введения.


Изолирование диазепама
Диазепам, являясь слабой кислотой и слабым основанием, способен существовать в водном растворе в виде ионизированных или неионизированных (молекулярных) форм в зависимости от pH среды. Степень ионизации вещества всегда приходится учитывать при изолировании ядов из биологического материала, так как растворимость ионизированных и неионизированных форм различна в воде и органических растворителях.
Изолирование диазепама проводят методом экстракции.
Изолирование диазепама из биологического материала основано но различной растворимости их ионизированной и молекулярной форм в воде и органических растворителях и на коэффициенте распределения молекулярной формы между водной и органической фазами

Сорг
Кр = ---------------
Своды

Где Кр – коэффициент распределения молекулярной фазы.
С – концентрация вещества в водной и органической фазах.
Чем выше Кр, тем эффективнее идёт экстракция.

В процессе изолирования диазепама из биологического материала взаимодействуют три компонента диазепам, биологический материал и экстрагент.
При исследовании тканевого материала (внутренние органы трупа) изолирование состоит из двух стадий: извлечение диазепама из твёрдой фазы в водную и извлечение диазепама из водной фазы в органический растворитель.
При исследовании биологических жидкостей (кровь, моча, промывные воды) необходимость в первой стадии изолирование отпадает и сразу проводится экстракция в органический растворитель.
Кроме реакции среды, на степень изолирования в значительной мере влияет природа экстрагента, его количество, время и кратность экстракции.
Количество экстрагента берётся вдвое больше по отношению к весу органов (1:2). Большие количества экстрагента, хотя и увеличивают эффективность экстракции, приводят к разбавлению извлечения и усложнению последующих операций, связанных с концентрированием веществ в извлечении.
Вторая стадия изолирования заключается в выделении их из водного извлечения путём экстрагирования органическим растворителем, не смешивающимися с водой, при различных значениях рН среды. Этим достигается концентрирование диазепама в извлечении и его частичная очистка от нормальных компонентов биоматериала (не растворимых в данном растворителе).
Используется также частный метод изолирования N-содержащих веществ (бензодиазепины) водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко).
Метод был разработан Львовской школой судебных химиков под руководством заведующего кафедрой аналитической и токсикологической химии Львовского медицинского института проф. В.Ф. Крамаренко.
Метод заключается в следующем: Настаивание измельчённого объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН2-3, в течение двух часов. Вода берётся в количестве 1:2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется. Операция повторяется двукратно.
Очистка водного извлечения от белковых соединений путём насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка.
Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путём экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают. Подщелачивание водного извлечения 20% раствором гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН= 9-10 (трёхкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием.

Методы идентификации диазепама
Подлинность диазепама устанавливают по характерным особенностям УФ-спектров поглащения. В УФ-спектре сибазона три максимума поглащения – при 240, 284 и 360 нм (растворитель смесь этанола и 0,1М раствора соляной кислоты). Подлинность диазепама можно также подтвердить методом ИК-спектроскопии. В ИК-спектре в таблетке из KBr проявляются интенсивные полосы поглощения при 3278 и 3125 см-1 (валентные колебания NH-групп), 1727 и 1706 см-1 (С-О-группы), 1575 и 1490 см-1 (С-С-группы).
Общей реакцией на производные бензодиазепина является реакция диазотирования и азосочетания первичной ароматической аминогруппы, образующейся после предварительного гидролиза препаратов при кипячении в соляной кислоте.
Диазепам такой реакции не даёт, т.к. имеет метильный заместитель в положении 1. Диазепам после гидролиза превращается в окрашенное производное бензофенона – 2-метиламино-5-хлор-бензофенон, имеющее жёлтую окраску:


Идентифицировать диазепам можно с помощью реакции пиролиза. При нагревании около 0,01г препарата в сухой пробирке над пламенем горелки образуется окрашенные в зелёный цвет плавы, сохраняющие окраску после добавления этанола вне зависимости от рН среды.
Воздействие щелочами в жёстких условиях (сплавление с гидроксидом натрия) приводит к деструкции молекулы диазепама и выделению из амидной группы метиламина, обнаруживаемого с помощью лакмусовой бумаги.

Органически связанные атомы хлора обнаруживают с помощью пробы Бейльштейна. Сущность этой пробы заключается в том, что препарат, внесённый на медной проволоке в бесцветное пламя горелки, окрашивает его в зелёный цвет. Окраска обусловлена образованием летучих галогенидов меди.

Атомы галогенов можно обнаруживать также путём сжигания в колбе с кислородом, используя в качестве поглощающей жидкости раствор гидроксида натрия. Затем подкисляют полученный раствор серной кислотой и выполняют реакцию на хлориды.
Также ковалентно связанный хлор можно минерализовать методом восстановительной минерализации. Прокаливают диазепам со смесью для спекания (KNO3, Na2CO3), а также действуют водородом в момент выделения (Zn+NaOH, Zn+CH3COOH). Образующийся галогенид – ион доказывают реакциями:



Образуется осадок серебра хлорида белого цвета, нерастворимый в минеральных кислотах, растворимый в гидроксиде аммония.
Ввиду наличия в молекуле третичного атома азота диазепам даёт положительные реакции с осадительными (общеалкалоидными) реактивами (Драгендорфа, Бушарда, пикриновой кислоты), а также с солью Рейнике.
Так, например, из раствора диазепама при добавлении пикриновой кислоты выпадают характерные жёлтые игольчатые кристаллы.





Реакция основана на образовании комплексных соединений, за счёт слабых основных свойств атома N в четвёртом положении.
Методы количественного определения диазепама.
Количественное определение диазепама выполняют методом неводного титрования, используя в качестве растворителей ледяную уксусную кислоту.
Титрантом во всех случаях служит 0,1М раствор хлорной кислоты. Эквивалентную точку устанавливают с помощью индикатора криссталлического фиолетого или потенциометрическим методом.








F эквивалентности вещества = 1

Количественное определение диазепама в лекарственных формах можно определить спектрофотометрическим методом по собственному поглощению растворов в различных растворителях, а также фотоколориметрическим методом с использованием цветных реакций. Данные методы основаны на способности вещества поглощать монохроматический свет при определённой длине волны.
При этих методах определяют оптическую плотность и находят С диазепама тремя способами: через закон Бугера-Ламберта-Бера ( D=l*E*C), по стандартному раствору с известной концентрацией (Сисследуемое=Dиссл.*Сстандартное/Cиссл.) и с помощью градуировочного графика (зависимость оптическая плотность D от концентрации С).
А также используют новые перспективные методы ВГЖХ (Высокоэффективной газожидкостной хроматографии) и ТСХ (тонкослойной хроматографии). Данные методы основаны на разном распределении веществ, в различных фазах (газ, жидкость), в случае ТСХ – распределении в тонком слое сорбента (чаще всего используют пластинки Silufol).
Список литературы

Д.А.Харкевич. «Фармакология». М.,1999 г.
М.Д.Машковский. «Лекарственные средства». Т.1 и 2, 2000.
РЛС-Энциклопедия лекарств М., 2007 г
О.Н. Давыдова, В.Л. Дорофеев, Т.А.Зацепилова, В.Н. Чубарев. «Формулярный справочник лекарственных средств». М., 1998 г.
Токсикологическая химия / под ред. Проф. Т.В.Плетнёвой. учебник для ВУЗов М., 2005 г.
Б.Г. Катцунг. «Базисная и клиническая фармакология».Т 1и2, 1998 г.
«Клиническая фармакология с основами фармакотерапии». Под редакцией В.И. Петрова. М., Альянс Б. 2000г.
Лужников Е.А., Гольдфарб Ю.С., Мусселиус С.Г. Детоксикационная терапия. – СПб, 2000.-192 с.
Лужников Е.А. Клиническая токсикология. – М., 1994. - сс. 113-118
Справочник «Видаль», М., 2000 г.
Государственный реестр лекарственных средств, 2000г
Михайлов И.Б. Основы рациональной фармакотерапии. – СПб., 1999. - 480 с.









- 24 -


Токсичность диазепама

Физико-химические свойства ксенобиотика.

Физико-химические свойства биологической среды.