Химико-токсикологическое определение фенобарбитала.

И. Попова). Согласно этому способу, биологический материал настаивают с водой подкисленной серной кислотой рН 2.0—3.0. Смесь биологического материала и подкисленной воды настаивают в течение 2 ч при частом перемешивании. Затем вытяжку сливают, а биологический материал еще 2 раза настаивают с новыми порциями 0,02 н. серной кислоты (по 80 мл) в течение I ч. Кислые водные вытяжки соединяют, процеживают через сложенную в 3 слоя марлю и центрифугируют в течение 25—30 мни.Центрифугат сливают с осадка и очищают от примесей методом гель-хроматографии, который обеспечивает хорошую очистку барбитуратов, выделенных из биологического материала.После очистки вытяжек из биологического материала с помощью гель-хроматографии получают большие объемы элюатов с низким содержанием барбитуратов. Поэтому элюаты подвергают экстракционному концентрированию. 3) Изолирование барбитуратов подщелоченной водой. В стакан или коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала.прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10% раствора гидроксида натрия. Содержимое стакана (или колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). От осадка отделяют надосадочную жидкость (центрифугат), к которой прибавляют 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и 1 н. серной кислоты (рН 2,0). Жидкость нагревают на кипяшей водяной бане в течение 20 мин. а затем подвергают центрифугированию в течение 30 мин. Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон.смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. Тампон промывают водой (10 мл), Промывную воду тоже выливают в делительную воронку. К процеженной жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин. Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10% раствора гидроксида натрия. Щелочной водный слой отделяют, подкисляют 25% раствором серной кислоты до рН 2.0 и взбалтывают с равным объемом диэтилового эфира. Полученную при этом эфирную вытяжку используют для обнаружения и количественного определения барбитуратов [6, c. 624].4.2 Методы идентификацииИдентификация фенобарбитала может производиться с помощью качественных хромогенных («цветных») реакций, реакций осаждения, микрокристаллоскопических реакции, методов хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии и др [2].Одной из первых качественных реакций на фенобарбитал была реакция Парри - взаимодействие барбитуратов с изопропиламином и солями кобальта, в результате которой образуются внутрикомплексные соединения, окрашенные в фиолетовый цвет:Рис.8. Структура комплексного соединениякобальта с фенобарбиталомПри взаимодействии фенобарбитала с пиридином и солями меди также образуются труднорастворимые(кристаллические или аморфные) комплексные соединения.Рис.9. Структура комплексного соединения меди с фенобарбиталом [2]Интересна реакция Цвиккера с солями кобальта и щелочами. От прибавления хлорида кобальта и гидроксида бария к барбитуратам образуется окрашенное соединение. Следует иметь в виду, что вода разлагает окрашенное комплексное соединение.Тест нитрата ртути также применяется для определения фенобарбитала. К насыщенному раствору нитрата ртути (I) прибавляют бикарбонат натрия до окончания выделения газа и образования жслюго осадка. Через некоторое время осадок меняет цвет на светло-коричневый. Используется только свежеприготовленный реактив (не более 1 ч). Перед употреблением реактив взбалтывают. Пробу растворяют в минимальном количестве этанола и добавляют каплю реактива. После перемешивания проверяют окраску в течение 2 мин. Одновременно проводят реакцию с чистым этанолом в качестве контроля. Темно-зеленое или черное окрашивание указывает на возможное присутствие вещества с имидной группировкой в кольце.Широкое распространение последнее десятилетие получили иммунохимические тесты. При исследовании барбитуратов ИХМ используются для проведения скрининга большого числа образцов, главным обрядом биологического происхождения. Получаемые при этом результаты позволяют сделать предположение о возможном наличии в тестируемом объекте вещества из группы барбитуратов без проведения внутригрупповой дифференцировки Продолжительность исследования обычно составляет от нескольких минут до нескольких часов [6, c. 628].К настоящему времени отечественными и зарубежными производителями налажен выпуск наборов и реактивов для ИФА, метода поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА), метода ингибирования латексной агглютинации, радиоиммунных методов (РИА), а также иммунохроматографические наборы. На результаты тестирования оказывает влияние тин используемого растворителя,рН среды, интенсивность излучения и температура проведения анализа. Важнейшее значение имеет реакционная способность иммунных реактивов.которые достаточно быстро, особенно при несоблюдении правил их хранения, теряют свою активность.Тонкослойная хроматография широко используется для исследования барбитуратов и большого числа веществ других групп — наркотиков, лекарств, пестицидов, метаболитов этих веществ. Этот вид хроматографии полезен в качестве препаративного метода. Хроматографирование барбитуратов обычно осуществляют на пластинах с закрепленными слоями силикагеля с добавлением флюоресцентного индикатора или без него.Системы растворителей• Система А: этиланетат-метанол — 25% раствор аммиака (85:10:5).• Система В: хлороформ — ацетон (80:20).• Система С: изонропанол: хлоро<1юрм: 25% раствор аммиака (90:90:20).После проведения разделения пластины тщательно просушивают для удаления следов хроматографической системы, особенно следов аммиака. Для этого их нагревают при 120 °С в течение 5 мин в термостате или обдувают горячим воздухом с помошью лабораторных фенов. Качество операции определяется по наличию запаха аммиака. Далее пластины просматривают в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм и отмечают наличие хроматографических зон, после чего их обрабатывают реактивом хлорида ртути с дифенилкарбазоном. Реактив хлорида ртути с дифенилкарбазоном обладает самой высокой чувствительностью к барбитуратам среди многих других, однако он высокотоксичен и должен быть использован с соответствующей предосторожностью[6, c. 630].Барбитураты проявляются в данных условиях в виде сине-фиолетовых пятен ни розовом фоне. Предел обнаружения составляет от I до 5 мкг барбитурата в пятне.Наиболее простым и информативным методом определения фенобарбитала в настоящее время является метод ВЭЖХ, позволяющтий определять фенобарбитал как качественно, так и количественно. Для разделения барбитуратов методом ВЭЖХ в качестве подвижной фазы (элюента) используется смесь 0,05 М водного раствора двухзамещенного фосфата аммония и метанола (60:40). Скорость потока элюирования составляет 100 мкл/мин. Детектирование барбитуратов проводится при длине волны 240 нм. Идентификация барбитуратов, содержащихся в биопробах, проводится по следующей методике:а) сопоставляются время (объем) удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения (контрольный раствор) фенобарбитала. Хромотограмма имеет вид, указанный на рис. 10[4, c.165]:б) сравниваются УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения (на рис. 11 приведены УФ-спектрыфенобарбитала и этаминала натрия в растворе подвижной фазы);в) оценивается совпадение значений времени удерживания определяемого компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в раствор экстракта из биопробы (концентрация образца должна быть близка к концентрации определяемого компонента);г) сопоставляются УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.Рис.11. УФ-спектрыфенобарбитала и этаминала натрия в растворе подвижной фазы4.3.Методы количественного определенияДля количественного определения барбитуратов, выделенных из биологического материала, применяют общеизвестные и широко распространенные фотоколориметрические и спектрофотометрические методы (предварительно аналит связывают в окрашенный комплекс с помощью одной из «цветных реакций»).Для количественного анализа барбитуратов в биопробахс помощью ВЭЖХ можно использовать различные методы, в том числе метод добавки, метод внешнего стандарта, метод внутреннего стандарта и т.д. Перспективно применение метода ИК-Фурье-спектрометрии в комбинации с методом ВЭЖХ. В таком случае повышается точность получаемых результатов. В соответствии с методом добавки проводят анализ раствора экстракта биопробы и этого же раствора, но с добавкой в него раствора, известной концентрации предполагаемого барбитурата (контрольного раствора). Анализы растворов «без добавки» и «с добавкой» должны проводиться в одном масштабе регистрации.Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта ,биопробы определяется по формуле:В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества. Концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводиться в одном масштабе регистрации. Концентрацию определяемого вещества (Ci) рассчитывают по формуле[4, c.167]:В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообъект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. В анализе барбитуратов в количестве внутренних стандартов рекомендуется использовать одно из следующих веществ: апробарбитал, метилфенобарбитал, фенилгидантоин и другие вещества.В данных условиях хроматографического разделения они должны полностью отделяться от других компонентов образца, должны элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта.Концентрацию определяемого вещества (Ci) рассчитывают по формуле:Причем калибровочный фактор Fi/вс вычисляется по формуле:ЗАКЛЮЧЕНИЕВпредставленной работе нами были рассмотрены важнейшие химико-токсикологическиесвойствафенобарбитала. В заключение, выпишем основные выводы по разделам курсовой работы.В первом разделе охарактеризованы общие свойства фенобарбитала. Химическое название вещества согласно международной номенклатуре ИЮПАК - 5-фенил-5-этилбар-битуровая кислота. Фенобарбитал является производным барбитуровой кислоты и применяется как противоэпилептическое лекарственное средство из обширной группы барбитуратов. Фенобарбитал представляет собой белый кристаллический порошок без запаха и со слабогорьким вкусом, слаборастворимый в воде, но хорошо растворимый в спирте и щелочах. Фенобарбитал является сильнодействующим успокаивающим, снотворным и противосудорожным средством, обладающим спазмолитическими и сосудорасширяющими свойствами. Относится к слабым наркотическим средствам. Вызывает привыкание при длительном употреблении. Выделяют клинические стадии интоксикациифенобарбиталом. При значительной передозировке препарата возможен летальный исход (летальная доза – 2-10 г), поэтому при отравлении требуется немедленное медицинское вмешательство. Специфичного антидота не существует. Противодействие отравлению осуществляется стандартными способами. В особо тяжелых случаях необходим гемодиализ.Во втором разделе работы рассмотрены токсикодинамические характеристики препарата. Наличием в составе молекулы фенобарбитала двух индольныхатомов обусловлена его способность образовывать водородные связи при взаимодействии с белками и, соответственно, активность препарата и длительность его воздействия (8-12 часов). Фенобарбитал обладает кумулятивным эффектом.Третий раздел работы посвящен токсикокинетическим характеристикам вещества. Длительность действия фенобарбиталаопределяется в первую очередь перераспределением, а не метаболизмом, либо элиминацией. После приема внутрь фенобарбитал полностью, но медленно всасывается в тонком кишечнике. Общаябиодоступность составляет 80%. Связывание с белками плазмы (преимущественно с альбумином) составляет 20-45%. T1/2 из плазмы у взрослых — 53-118 ч (в среднем 79 ч), у детей и новорожденных (возраст менее 48 ч) — 60-180 ч, в среднем 110 ч. Клиренс фенобарбитала у взрослых составляет 0,062±0,013 мл/(мин.кг). Практически все барбитураты, в том числе и фенобарбитал,биотрансформируются до неактивных метаболитов, которые затем выводятся с мочой.В четвертом, заключительном, разделе данной работы описана методология проведения качественного и количественного анализа на содержание фенобарбитала у живых лиц и в трупном материале.У живых лиц практикуется анализ крови и мочи на фенобарбитал. В последнее время, с развитием аналитического оборудования, практикуется анализ волос, ногтей, пота и слюны, содержащих значительно меньшее количество биоматериала и, следовательно, поглощенного фенобарбитала. Барбитуратов и, в частности, фенобарбитал, в трупном, загнившем материале, достаточно стабильны, и сохраняются достаточно длительное время (более полугода) при низкой степени извлечения.Изолирование барбитуратов осуществляется несколькими способами: нейтральной водой, водой, подкисленной серной кислотой, а также подщелоченной водой по методикам, описанным в работе.Идентификация фенобарбитала может производиться с помощью качественных хромогенных («цветных») реакций, реакций осаждения, микрокристаллоскопических реакции, методов хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии и др.При количественном определении фенобарбитала используются преимущественно методы ВЭЖХ, УФ-спектроскопии, фотометрия и спектрометрия. Методики проведения анализа в целом стандартны для аналитической химии (метод добавок, метод внешнего и внутренного стандартов).СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫБарбитуровая кислота и ее производные. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://toxichemistry.ru/shvaykova/veschestva-ekstragiruemyie-iz-kislogo-rastvora/barbiturovaya-kislota-i-ee-proizvo.htmlБарбитураты и методы их исследования. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.xumuk.ru/toxicchem/71.html.Горская М.Н. Судебно-медицинские аспекты отравлений фенобарбиталом. Афтореферат к диссертации. – СПб, Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт., 1992.Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств. Под ред. проф. Б. Н. Изотова. М., изд-во «Мысль», 1993. – 271 с.Елизарова О.Н., Жидкова Л.В., Кочеткова Т.А. Пособие по токсикологии для лаборантов. М.: Медицина, 1974. – 169 с.Калетина Н.И. (ред.) Токсикологическая химия Метаболизм и анализ токсикантов. Учеб.пособие. - М.:Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007.-1008 стр.Клиническая токсикология. Фенобарбитал. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.kuban.su/medicine/shtm/baza/lek/klfhtm/part8/8-247.htmКурляндский Б.А., Филов В.А. (ред.) Общая токсикология. М.: Медицина, 2002. - 608 с.МелентьевА.Б.Определение фенобарбитала и циклобарбитала в крови методом газовой хроматографии - масс спектрометрии с использованием микроэкстракции. // Известия Челябинского научного центра, 2004, № 2 (23), с. 47 – 51.Симонов Е.А., Найденова Л.Ф., Ворнагов С.А. Наркотические средства и психотропные вещества, контролируемые на территории Российской Федерации. Под ред. Рогозина ВВ. - М.: «InterLab», 2003. – 412 с.Суворов А.В. Справочник по клинической токсикологии. Нижний Новгород: Изд. НГМА, 1996 - 91 с.Рожнов Г.И. Шашкина Л.Ф. Фенобарбитал // Токсикологический вестник, 2000, № 1.-С.40-41.Фенобарбитал (Phenobarbital) - инструкция по применению, описание, Фармакологическое действие, показания к применению, дозировка и способ применения, противопоказания, побочные действия [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://gipocrat.ru/farmacied_d4_10.phtml.