метаболический потенциал микробов-экстремофилов в различных сферах биотехнологии

Ни одно другое биологически произведенноевещество не достигло отметки в один миллиард галлонов. Природная способность дрожжей метаболизировать сахара в этанол с высоким выходом конечного продукта позволяет избежать необходимости глубокого вмешательства генной инженерии. Тем не менее, рыночный успех этанола доказывает, что биохимическое производство возможно в промышленных масштабах, и недавно начавшееся расширение биологических производств ряда других химических веществ (молочная кислота, 1,3-пропандиол, 1,4-бутандиол, янтарная кислота и т.д.) лишь подтверждает это. [14].В качестве показательного примера можно рассматривать совместное предприятие между Dupont и Tate & Lyle, которое стало первым достигшим масштаба в тысячи тонн в год получаемого рыночного химического вещества с использованием метаболически сконструированного хозяина. Производство 1,3-пропандиола из кукурузного крахмала началось в 2006 году, и почти десятилетие спустя компания сообщила о прогрессе в расширении производства. В последние годы возникли новые коммерческие объекты, что представляет собой огромные капиталовложения. Переход от локальных демонстрационных производств к промышленному масштабу показывает, что инвестиционное сообщество с оптимизмом смотрит на будущие перспективы биопроизводства. Несмотря на то, что сейчас практически не используются термофильные организмы в подобных производствах, большая часть исследований данных проектов в рамках коммерческого масштаба была начата еще десять лет назад – то есть до того, как были доступны основные инструменты для генетического манипулирования термофилами. Опыт, полученный в этих первоначальных проектах, может служить дополнительным доказательством преимуществ термофильных процессов.Генетические системы для нескольких видов экстремальных термофилов в настоящее время достаточно изучены, чтобы можно было начать разработку метаболически сконструированных штаммов для производства промышленно значимых химических веществ, однако пока только P. furiosus достиг значительного прогресса в этой области [14]. Имеется ряд преимуществ в работе с теплолюбивым организмом. Например, в случае P. furiosus это использование температуры для регуляции экспрессии рекомбинантных ферментов, что позволяет перейти от фазы роста, когда субстрат расходуется на увеличение клеточной биомассы, до производственной фазы, где субстрат в основном превращается в продукт, а метаболизм клеток биомассы сводится к минимуму. Сходный температурный сдвиг был выполнен с E.coli, где клетки охлаждали до 10-15°С перед экспрессией, чтобы улучшить растворимость рекомбинантного белка, и этот метод достаточно распространен в лабораторных масштабах, однако затраты на охлаждение делают его невозможным для промышленного процесса. При этомдлявызова холодного шока у термофилов достаточно использовать окружающей воды или воздуха в качестве акцептора тепла [14].Еще одним значительным преимуществом термофильного производства является минимизация риска загрязнения. Биоперерабатывающие заводы испытывают два основных типа загрязнения: 1) Хронические, низкоуровневые инфекции, которые могут снизить выход продукта, но в условиях больших масштабов их так трудно «вывести», что они были приняты как неизбежный аспект производства на многих заводах кукурузного этанола;2) Тяжелые инфекции, которые крайне трудно предугадать, могут поставить под угрозу жизнеспособность целого производственного узла, что приведет к «застрявшему брожению» и потребует полного отключения потока [14].Ряд исследований показал, что наличие стерильного исходного сырья или антибиотиков в биореакторе недостаточно для предотвращения заражения оппортунистическими бактериями, которые процветают в присутствии большого количества питательных веществ и при мягких условиях, присутствующих в мезофильномбиореакторе. Использование теплолюбивого штаммапредполагает, что все отсеки производства могут работать при повышенных температурах, где нет «безопасных» углов для создания полноценного резервуара загрязняющих микроорганизмов. Преимущества эффективности термофильного процесса за счет отсутствия контаминации на сегодняшний день трудно определить количественно, однако потери производства из-за хронического загрязнения на заводах по производству этанола были оценены где-то между 2 и 22%. Стоимость серьезных случаев загрязнения (приводящих к «застрявшим» брожениям) оценить еще труднее, поскольку в литературных данных мало информации об их частоте.Несмотря на то, что использование чрезвычайно теплолюбивого микроорганизма снизит риск бактериального заражения на биопроизводствах, актуальной проблемой остается вероятность вирусных инфекций. Были идентифицированы вирусы, поражающие как бактериальных термофилов, так и архей, хотя важно отметить, что обнаруженные инфицированные архейные виды ограничиваются только типом кренархеоты[6]. Для типа эвриархеоты еще не зарегистрировано ни одного вируса, хотя наличие системы CRISPR у T. kodakarensisи у P. furiosus свидетельствует о том, что и у них встречаются случаи вирусных инфекций. Нативная система CRISPR T. kodakarensis была разработана для нацеливания на специфические последовательности чужеродной ДНК. Это указывает на то, что систему CRISPR T. kodakarensis можно использовать для «иммунизации» промышленных штаммов от проблемных вирусов способом, аналогичным тому, который уже применяется в коммерческих продуктах на производствах сыров и йогуртов[14].Одной из часто упоминаемых проблем использования термофилов в промышленных ферментациях является энергия, необходимая для нагревания процесса. Существует два основных требования: стерилизация и поддержание температуры ферментера. Cтерилизация необходима для мезофильной ферментации, чтобы избежать загрязнения, и часто достигается путем нагревания до 121 °C в течение короткого периода (до 60 минут), а затем охлаждения до целевой температуры культивирования. Соответственно, для термофильной ферментации тепловые затраты процесса стерилизации могут быть потенциально снижены, а выносливые бактериальные споры могут выдерживать воздействие высоких температур, но при этом не могут расти на них.Поддержание температуры ферментера фактически дает возможность для экономии энергии в случае использования термофила. Все организмы производят тепло как побочный продукт метаболических процессов. В больших масштабах выделяемое метаболическое тепло перевешивает потерю тепла в окружающую среду через стенки ферментера или испарение и в результате требуется охлаждение для поддержания постоянной температуры ферментера. Режим охлаждения для большого биореактора с высокой плотностью культуры чрезвычайно высок и может быть одним из сдерживающих факторов для увеличения ферментации. Еще одной трудностью для мезофильных ферментаций является малая тепловая движущая сила между температурой ферментации и окружающей средой, которая ограничивает отвод тепла, часто делая необходимым охлаждение – а это дополнительные энергетические затраты. Вырабатываемое метаболическое тепло и, следовательно, требуемый отвод тепла зависят в первую очередь от метаболической активности культуры, а не от температуры ферментера или используемого организма. Таким образом, термофильная ферментация потребует такого же количества отвода тепла, что и мезофильная ферментация. Кроме того, это тепло намного легче удалить из-за большой разницы температур между термофильным брожением и окружающей средой, что обеспечивает существенное снижение затрат [1].Дополнительной возможностью экономии энергии при термофильной промышленной ферментации является разделение продукта, которое нередко является наиболее энергоемкой частью процесса, поскольку его часто проводят при повышенных температурах. В частности, термофильное производство летучих продуктов (например, топливные спирты) обеспечивает возможность облегченного удаления продукта. Использование теплолюбивых организмов было бы весьма благоприятно для большинства процессов разделения, извлекающих летучие продукты из ферментационного бульона, включая дистилляцию, отгонку газа и первапорацию[33].Хотя метаболическая инженерия открывает возможность встраивания желаемых химических путей в любого генетически изменяемого хозяина, стоит помнить, что вид S. cerevisiae, основный биологический объект для производства биоэтанола, стал лидировать в этой области, потому что изначально был отличным продуцентом этанола. Тот факт, что соответствующие ферменты могут быть введены в организм, не означает, что полученный мутант будет промышленно полезен. Следовательно, желательные для промышленного производства штаммы должны быть выбраны не только как удобный объект для генетических модификаций, но и как изначально перспективный продуцент необходимого продукта. Группа экстремальных термофилов, упомянутая выше, изначально обладает множеством желаемых свойств. Многие способны метаболизировать разнообразные наборы сахарных полимеров и мономеров, аCaldicellulosiruptorbescii может даже разрушать необработанную лигноцеллюлозную биомассу. Metallosphaerasedula и виды Sulfolobus хорошо растут при низких значениях pH, что является значительным преимуществом для получения таких кислых продуктов, как молочная и 3-гидроксипропионовая кислоты, которые легче очищать в их протонированных формах. Способность M. sedula растворять металлы путем их окисления находит применение в биологическом выщелачивании, в то время как его новый путь фиксации углерода предлагает потенциальную альтернативу циклу Кальвина, зависящему от RuBisCo, для усвоения углерода.Хотя такие анаэробы, как P. furiosus, потенциально являются хорошими производителями продуктов брожения, необходимо учитывать, что они способны извлекать только часть энергии, от получаемой аэробами в случае одних и тех же субстратов. Состояние постоянного ограничения энергии, делает проблематичными даже незначительные энергетические затраты. Следовательно, экспрессия в анаэробных штаммах должна быть сосредоточена на путях, которые являются либо энергетически нейтральными, либо вырабатывающими энергию [14].ЗАКЛЮЧЕНИЕНесмотря на естественные преимущества экстремозимов, фактическое количество доступных экстремофильныхбиокаталитических средств очень ограничено. Работа с экстремофилами и/или экстремозимами требует адаптации и создания новых методов, которые будут работать в нестандартных условиях. Многие из инструментов, которые в настоящее время используются в классических микробиологических и биохимических экспериментах, не могут быть применены к экстремофильным исследованиям, потому что они не обладают химическими и / или механическими свойствами, чтобы противостоять экстремальным условиям. Точно также методы исследования микроорганизмов должны быть дополнительно скорректированы, чтобы соответствовать особенностям жизнедеятельности экстремофилов. Классическим примером является нанесение гипертермофилов на твердую питательную поверхность. Обычные опыты на агаровых средах практически неосуществимы, поскольку агар тает и вода быстро испаряется при таких высоких температурах. Существуют альтернативные отвердители для выращивания термофилов и гипертермофилов, например, силикагель, крахмал и гелрит, а также низкоацетил-геллановая камедь, изготовленная из Pseudomonas. Кроме того, большой технический разрыв между производством фермента в лабораторных условиях и получением конечного коммерчески пригодного продукта все еще является проблемой для разработки новых биокатализаторов. Важно также обратить внимание, что настоящее время, очевидно, ископаемое топливо не может продолжать использоваться в нынешних масштабах, не нанося при этом непоправимого вреда окружающей среде. Отказ от нефти потребует кардинальных изменений в текущем режиме моторного топлива, но также существенно изменит производство пластмасс, растворителей и других специальных химикатов, которые в настоящее время производятся на химических нефтеперерабатывающих заводах. Экстремальные термофилы благодаря своим уникальным преимуществам и благодаря развитию метаболической и генетической инженерии, могут рассматриваться как потенциальная замена для удовлетворения потребностей в массовом химическом производстве из возобновляемого сырья. Они способны выдерживать высокие температуры, которые могут быть вызваны теплом, генерируемым в крупномасштабных биореакторах, и при этом способствовать снижению риска контаминации. Многие также проявляют уникальные метаболические свойства из-за их приспособленности к жизни в экстремальной окружающей среды. В настоящее время существует достаточное количество генетические инструменты, позволяющие перевести экстремофилов к выходу на биологические производства, однако требуется еще много работы для полноценной реализации их потенциала. С установленным коммерческим успехом в таких секторах биотехнологии как производство ДНК-полимераз, биотоплива, каротиноидов, а также в биоминировании, экстремофилы и их ферменты могут приобрестинадежнуюплатформу на рынке, которая, в перспективе, будет только продолжать расти. Однако, чтобы реализовать этот огромный потенциал, необходимо продолжать разрабатывать инновационные методы для преодоления существующих препятствий. Одной из проблем является отсутствие способности производить большинство экстремофилов/экстремозимов в масштабах, необходимых для промышленных процессов, хотя некоторые рекомбинантные экстремозимы могут продуцироваться в больших количествах мезофильными организмами, такими как E.coli. В будущем необходимо решить ряд научных задач, прежде чем появится возможность полностью реализовать потенциал экстремозимов.Другим существенным препятствием является общее отсутствие партнерских отношений между научным обществом, промышленностью и правительством, однако именно совместная работа этих трех сторон будет способствовать достижению наибольшего прогресса.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Бутова С.Н., Эль-Регистан Г.И., Типисева И.А., Грачева И.М. Теоретические основы биотехнологии. – Москва: Издательство «Элевар», 2003. – 554 с. 2.Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. — Москва: Издательство «Академия», 2003. — 208 с.3.Чечина, О. Н. Общая биотехнология : учебное пособие для вузов / О. Н. Чечина. — 2-е изд., перераб. и доп. — Москва: Издательство Юрайт, 2019. — 231 с.4.Шлегель Г. Общая микробиология / пер. Алексеевой Л.В. – Москва: Издательство «Мир», 1987. – 567 с. 5.A novel highly thermostable xylanase stimulated by Ca2+ from Thermotogathermarum: cloning, expression and characterization / Shi H., Zhang Y., Li X. et al. // Biotechnol Biofuels – 2013. – V. 6. – №26. – pp. 1-9.6.Archaeal viruses and bacteriophages: comparisons and contrasts / Pietilä M. K., Demina T. A., Atanasova N. S. et al. // Trends Microbiol. – 2014. – V. 22. – pp. 334–344.7.Azubuike C.C., Chikere C.B., Okpokwasili G.C. Bioremediation techniques–classification based on site of application: principles, advantages, limitations and prospects // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2016. – V. 32. – pp. 1–18.8.Bartlett J. M., Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction // Methods Mol Biol – 2003. – V. 226. – pp. 3–6.9.Biotechnological applications of extremophiles, extremozymes and extremolytes // Raddadi N., Cherif A., Daffonchio D. et al. // Appl Microbiol Biotechnol – 2015. – V. 99. – pp. 7907–7913.10.Cavicchioli R., Thomas T. Extremophiles // Encyclopedia of Microbiology — Second. — San Diego: Academic Press, 2000. — Т. 2. — С. 317—337.11.Chandi G.K., Gill B.S. Production and Characterization of Microbial Carotenoids as an Alternative to Synthetic Colors: A Review / Int J Food Prop – 2011. – V. 14. – №3. – pp. 503–513.12.Coker J.A. Extremophiles and biotechnology: current uses and prospects // F1000 Faculty Rev – 2016. – V. 5. – №396. – pp. 1-7.13.Engineering hydrogen gas production from formate in a hyperthermophile by heterologous production of an 18-subunit membrane-bound complex / Lipscomb G.L., Schut G.J., Thorgersen M.P. et al. // J Biol Chem – 2014. – V. 289. – №5. – pp. 2873–2879.14.Extremely thermophilic microorganisms as metabolic engineering platforms for production of fuels and industrial chemicals / Zeldes B.M., Keller M.W., Loder A.J. et al // Front Microbiol – 2015. – V. 6. – №1209. – 1-17.15.Feller G. Psychrophilic enzymes: from folding to function and biotechnology // Scientifica (Cairo) – 2013. – pp. 1-28.16.From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes / Singh R. K., Tiwari M. K., Singh R. et al // Int J Mol Sci – 2013. – V. 14. – pp. 1232–1277.17.Historical perspective of biofuels: learning from the past to rediscover the future / Songstad D. D., Lakshmanan P., Chen J. et al. // In Vitro Cell Dev Biol – 2009 – V. 45. – pp. 189–192.18.Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase in water-soluble nanolipoprotein particles / Baker S.E., Hopkins R.C., Blanchette C.D. et al. // J Am Chem Soc – 2009. – V. 131. – №22. – pp. 7508–7509.19.Immobilized lignin peroxidase from Ganoderma lucidum IBL-05 with improved dye decolorization and cytotoxicity reduction properties / Shaheen R., Asgher M., Hussain F., et al. // Int. J. Biol. Macromol – 2017. – V. 103. – №57–64.20.Joshi S., Satyanarayana T. Biotechnology of cold-active proteases // Biology (Basel) – 2013. – V. 2. – №2. – pp. 755–783.21.Kasana R. C., Gulati A. Cellulases from psychrophilic microorganisms: a review // J Basic Microbiol – 2011. – V. 51. – №. 6. – pp. 572–579.22.Kumar S., Nussinov R. How do thermophilic proteins deal with heat? // Cell Mol Life Sci – 2001. – V. 58. – pp. 1216–1233.23.Ladkau N., Schmid, A. Bühler, B. The microbial cell—functional unit for energy dependent multistep biocatalysis // Curr. Opin. Biotechnol – 2014. – V. 30. – pp. 178–189.24.Metal and organic pollutants bioremediation by extremophile microorganisms / Giovanella P., Vieira G.A.L., Ramos Otero I.V. et al. // J. Hazard. Mater. – 2020. – V. 382. – pp. 1-14.25.Peeples T.L. Bioremediation Using Extremophiles // Microbial Biodegradation and Bioremediation – 2014. – p. 251-268.26.Production of lignofuels and electrofuels by extremely thermophilic microbes / Keller M., Loder A. J., Basen M. et al. // Biofuels – 2014. – V. 5. – pp. 499–515.27.Protein Adaptations in Archaeal Extremophiles / Reed C. J., Lewis H., Trejo E. et al. // Archaea – 2013. – V. 2013. – pp. 1-14.28.Quorum-sensing inhibitory compounds from extremophilic microorganisms isolated from a hypersaline cyanobacterial mat / Abed R.M., Dobretsov S., Al-Fori M. et al. // J Ind Microbiol Biotechnol – 2013. – V. 40. – №7. – pp. 759–772.29.Roohi R., Kuddus M., Saima S. Cold-active detergent-stable extracellular α-amylase from Bacillus cereus GA6: biochemical characteristics and its perspectives in laundry detergent formulation // J. Biochem. Technol. – 2013. – V. 4. – pp. 636–644.30.Sarmiento F., Peralta R., Blamey J.M. Cold and hot extremozymes: industrial relevance and current trends // Front BioengBiotechnol – 2015. – V. 3. – №148. – p. 1-15.31.Sharma A., Satyanarayana T. Cloning and expression of acidstable, high maltose-forming, Ca2+-independent α-amylase from an acidophile Bacillus acidicola and its applicability in starch hydrolysis / Extremophiles – 2012. – V. 16. – №3. – pp. 515–522.32.The modular respiratory complexes involved in hydrogen and sulfur metabolism by heterotrophic hyperthermophilic archaea and their evolutionary implications / Schut G. J., Boyd E. S., Peters J. W. et al. // FEMS Microbiol Rev. – 2013. – V. 37. – pp. 182–203.33.Vane L. M. Separation technologies for the recovery and dehydration of alcohols from fermentation broths / Biofuels Bioproducts Biorefining – 2008. – V. 2. – pp. 553–588.34.Vera M., Schippers A., Sand W. Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation--part A // Appl Microbiol Biotechnol. – 2013. – V. 97. – №17. – pp. 7529–7541.35.Waksman S.A, Schatz A., Reynolds D.M Production of antibiotic substances by actinomycetes // Ann N Y Acad Sci. – 2010. – V. 1213. – pp. 112–124.