Тема: исследование фотоиндуцированных превращений протеолитических ферментов в условиях воздействия вуф- излучения.

Хроматофоры при поглощении УФ излучения обычно переходят в первое возбужденное синглетное состояние с коротким временем жизни. Это синглетное состояние легко теряет энергию при конверсии в триплетное состояние или при переносе энергии на другие группы при столкновениях с другими молекулами. Образующиеся в результате триплетные состояния обычно обладают более длинными временами жизни (порядка микросекунд), чем синглетное, и могут вступать в реакции переноса электрона или отрыва атома водорода. Преобладающей является реакция гидратированного электрона с O2 с образованием O2–•. Также гидратированный электрон реагирует со свободными карбоксильными группами в белках (С-конец и остатки аспарагина/глутамина), аминогруппами (N-конец и остатки лизина), что приводит к деаминированию и отрыву атома водорода, и с другими белковыми остатками. Непрямое фотоокисление белков происходит через формирование и последующие реакции синглетного кислорода с остатками триптофана, гистидина, тирозина, метилаланина и цизина. В щелочных растворах (рН 1>10) O2 реагирует также с аргинином и лизином в депротонированной форме.Спектр фотобиологического действия (зависимость фотобиологического эффекта от длины волны действующего света) поглощения трипсина лежит в области, отмеченной на рисунке 6.Рисунок 6 – Спектр поглощения трипсинаМолекула трипсина имеет приблизительно сферическую форму с углублением активного центра, на поверхности которого расположены остатки аспарагиновой кислоты, гистидина, серина, триптофана, тирозина и цистина.Гистидин не имеет хромофорных групп, поэтому большинство реакций с участием гистидина, приводящих к повреждениям, происходят посредством фотосенсибилизированных процессов. Исследования модельных соединений гистидина в присутствии флавинов, а также других фотосенсибилизаторов, показали формирование короткоживущих радикалов с радикальным центром на имидазолиле. Окисление гистидина как в свободном состоянии, так и всоставепептидовсинглетнымкислородомприводит к образованию эндопероксидов (рис. 7), разложение которых при комнатной температуре в органическихрастворителях ведет к образованию аспарагиновой кислоты, аспарагина, мочевины идругих продуктов. В водных растворах свободный гистидин также дает бицикличныепродукты.Рисунок 7 – Образование эндопероксида из гистидинаТриптофан, тирозин и цистин являются хромофорами, обуславливающими спектр поглощения трипсина.Индольное кольцо триптофана является самым сильным УФ-хромофором в белках(с полосой поглощения, отличающейся высоким молярным коэффициентом поглощения,которое происходит на бóльших длинах волн, чем для любого другого из аминокислотныхостатков), однако важность триптофана как хромофора невысока вследствие егоотносительно низкого содержания во многих белках. Тем не менее, фотовозбуждениетриптофана приводит к целому ряду фотохимических реакций. Первое триплетноесостояниетриптофана3(Trp)быстровступаетвреакциипереносаэлектронаподходящими акцепторами электрона, что приводит, например, в реакциях сдисульфидами к образованию катион-радикала триптофана (Trp+•) и анион-радикалов(RSSR–•).Образующийсякатион-радикалтриптофанабыстродепротонирует с образованиемнейтральногорадикалаTrp•.Последующиереакциинейтральногоиндолильного радикалаTrp•с кислородом O2 дают кольцевой С-3 пероксильный радикал,который далее участвует в реакции отрыва атома водорода. Остатки триптофана также могут участвовать в процессах прямой фотоионизации,которая происходит в результате как в одно-, так и двух-фотонных процессах. Вдополнениекпрямойфотоионизации,остаткитриптофаналегкоокисляютсяприсутствии синглетного кислорода 1O2, что приводит к образованию диоксетановыхинтермедиатовчерезобразованиеС2-С3двойнойсвязивтриптофанеилигидропероксидов в позиции С3. Данные интермедиаты могут впоследствиипревращаться в N-формилкинуренин (и далее в кинуренин при гидролизе), а также впроизводныегидроксипироллоиндола.N-формилкинурениникинуренинявляютсянаиболее важными продуктами окисления триптофана, так как являются более сильнымифотосенсибилизаторами по сравнению с исходной аминокислотой и могут участвовать вбольшом количестве деградирующих белки процессов.Катион-радикал тирозина может образоваться в результате прямой фотоионизации. Tyr участвует в похожих реакция переноса электрона, как для случая Trp, чтоведет к образованиюTyrОН+•, который быстро депротонирует, образуя феноксильныйрадикал. Формирующиеся в результате этих процессов феноксильные радикалытирозина вступают в большое количество реакций: окисления подходящих субстратов,димеризации с образованием дитирозиновых аддуктов и отрыва атома водорода. Такжефеноксильный радикал тирозина эффективно восстанавливается низкомолекулярнымиантиоксидантами, такими как аскорбат, глутатион и селеноцистеин. Фотоокислениеостатков тирозина синглетным кислородом приводит к формированию нестабильныхэндопероксидов, которые быстро разлагаются с образованием С1 гидропероксидов ициклических продуктов.Окислительная модификация ферментов приводит прежде всего к их инактивации, нарушению конфигурации или фрагментации белковой молекулы, образованию белковых агрегатов.ВУФ излучение оказывает существенное влияние на протеолитические ферменты, в его механизме действия на белки и аминокислоты доминирует необратимое повреждение, исследование этих процессов имеет важное значение для определения физико-химических основ его биологического действия.