Биосинтез L-молочной кислоты на основе рекомбинантных штаммов дрожжей

Одной из основных проблем, связанных с производством молочной кислоты с использованием дрожжей, особенно S. cerevisiae, является способность дрожжей производить этанол в присутствии избытка глюкозы. Несмотря на то, что экспрессия гена лактатдегидрогеназы сама по себе может в некоторой степени снизить превращение глюкозы в этанол (Dequin, Barre, 1994), модификация пути синтеза этанола для устранения его конкуренции с лактатдегидрогеназой за пируват оказалась эффективным способом увеличения выхода глюкозы. Единственная делеция гена PDC1 пируватдекарбоксилазы, кодирующего основной изофермент PDC в S. cerevisiae, умеренно снижает активность PDC, но экспрессия гена PDC5 значительно возратала в отсутствие PDC1 (Ishida et al., 2005). Двойная делеция PDC1 и PDC5 в штаммах S. cerevisiae, продуцирующих молочную кислоту, уменьшала продукцию этанола и значительно увеличивала выход молочной кислоты, но все же некоторое количество этанола производилось, потому что ген PDC6 был интактным. Кроме того, рост штаммов с делецией PDC1 и PDC5 был сильно снижен на среде с глюкозой (Ishida et al., 2006), что может быть нежелательным в производственном процессе. Напротив, делеция единственного гена, кодирующего пируватдекарбоксилазу, PDC1, из K. lactis оказывало лишь незначительное влияние на рост, было достаточным для устранения выработки этанола и повышения выработки лактата.В работеBranduardi с соавт. (2006)была проанализирована продукциямолочной кислоты из метаболически сконструированных клеток Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующих гетерологичный ген лактатдегидрогеназы (LDH). Экспрессия генов лактатдегидргеназ в клетках дрожжей вводит новый и альтернативный путь для NAD + регенерации, что позволяет осуществить прямой перевод внутриклеточного пирувата в лактат. Четыре различных штамма S. cerevisiae были трансформированы шестью разными генами дикого типа и одним мутагенизированным геномLDH в комбинации или без переносчика лактата. Полученные значения урожайности (граммы произведенного лактата на грамм потребленной глюкозы) варьировались от 0,0008 до 0,52 г. В исследовании Ookubo с соавт. (2008) попытались идентифицировать гены-мишени для молекулярного разведения рекомбинантного штамма S. cerevisiae, несущего кДНК гена лактатдегидрогеназы человека, чтобы улучшить его лактатную продуктивность, используя данные микроматрицы ДНК. Они сравнили полные данные экспрессии генов штамма S. cerevisiae SW029-1B, продуцирующего L-лактат, несущего pTRS48, несущий кДНК L-лактатдегидрогеназы человека, штамм № 48, с SW029-1B, несущим пустой вектор pTRS11 и штамм № 11 с использованием ДНК-микрочипа 3DGene. В штамме № 48, ген L-лактатдегидрогеназы человека на pTRS48 экспрессируется с промотора гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы S. cerevisiae. Кроме того, как pTRS11, так и pTRS48 несут ген URA3 S. cerevisiae в качестве селективного маркера дрожжей. Штаммы дрожжей культивировали микроаэробно при медленном перемешивании в синтетической полной минусурациловой среде (SC-Ura), состоящей из 0,67% дрожжевого азотного основания без аминокислот, 0,192% дрожжевого синтетического выпадения без урацила, 0,012% сульфата аденина и 5% глюкозы при 30° C. Во время культивирования pH в культуре поддерживался автоматическим добавлением 2 M NaOH. Штамм № 48 продуцировал примерно 15 г / л L-лактата из 50 г / л глюкозы, потребленной при pH 5,0, но потребление глюкозы в штамме № 48 был медленнее, чем у штамма № 11 из-за более низких темпов роста.В исследовании Ilmén с соавт. (2013) были разработаны векторы и методы для внесения генетических модификаций в нетрадиционные дрожжи C. sonorensis, которые впервые сделали возможным его генную инженерию. C. sonorensis - это метилотрофные дрожжи, которые легко ферментируют глюкозу до этанола, используют несколько источников углерода, включая пентозные сахара, ксилозу и арабинозу, относительно устойчивы к кислым условиям и имеют простые пищевые потребности (Ganter et al., 2004). Целью работы Ilmén с соавт. было создание штаммов C. sonorensis, экспрессирующих гетерологичный ген лактатдегидрогеназы и содержащий интактный или модифицированный путь ферментации этанола, и характеристика эффектов этих модификаций на продукцию молочной кислоты. Штаммы, экспрессирующие L - лактатдегидрогеназу из Lactobacillus helveticus, Bacillus megaterium, и из гриба Rhizopus oryzae сравнивали и оценивали по их относительной эффективности в производстве лактата С. sonorensis. Эффект повышения уровня активности лактатдегидрогеназы в результате экспрессии нескольких копий гена на геном был определен в штаммах, содержащих функциональный путь этанола, и в штаммах, в которых были удалены PDC гены. Эти исследования показали, что продукция лактата, этанола и пирувата определяется модификациями PDC, выбором фермента LDH и уровнем активности фермента LDH, который варьируется в зависимости от количества копий гена LDH.ЗАКЛЮЧЕНИЕМанипуляции с метаболическими путями для улучшения свойств и продуктивности микроорганизмов становятся широко признанной концепцией. Для производства важных метаболитов, а также для лучшего понимания основ клеточной биологии необходимы подробные исследования.Получение качественной молочной кислоты в большихпроизводственных объемах является одной из важных задач современной биотехнологической науки. В отличие от прошлых применений рацемической молочной кислоты, L-молочная кислота в качестве мономера для синтеза поли-L-молочной кислоты должна обладать самой высокой оптической и химической чистотой. В последнее время производство L-лактата микробами стало широко распространяться.Особенности биосинтеза молочной кислоты требуют разработки новых подходов к этому процессу и получение рекомбинантных штаммов-продуцентов дрожжей является одним из них. Дрожжи считаются привлекательными альтернативными хозяевами для производства молочной кислоты при низком pH, поскольку они более устойчивы к кислоте, чем молочнокислые бактерии. И, следовательно, могут быть использованы для более эффективного промышленного синтеза L-молочной кислоты.Список литературы