Получение многоканальных антител с помощью гибридомной технологии

Полученные клоны можно заморозить при – 70°С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы – это опухолевые клетки), где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны физико-химически, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы (Абелев Г. И., 1998; ZhangC., 2012).2. 1 Протокол иммунизации с использованием полного адъюванта ФрейдаОгромноеколичествометодик по подготовке АГ было использовано для создания МАТ. Нижепредставленобщий (стандартный)протоколдля продукции большего числа АТ. Он основывается на введении эмульсии с АГ перитонеально в нужный вид, причем повторное введение производится с 10 по 14 дни после первой иммунизации. 3 дняспустяпослеповторнойиммунизацииселезенкаживотногобудет готова к слиянию.Рисунок 2 – Стадии продукции МАТ с применением общего/стандартного, альтернативного и дополнительного протоколов (Yokoyama, W. M., 2013).1. Подготовьтеантигенсиспользованиемот 2 × 106 до 5 × 107 клетокилиот 1 до 50 μgбелка или пептида для 1 иммунизируемого животного в солевом растворе.2. Погрузитеантигенвстерильный 1 или 2 млстеклянныйшприцсLuer-Lokкреплением иглы, после чего соедините шприц с трехходовым краном.3. РесуспензируйтеполныйадъювантФрейда (ПАФ)длядиспергированияMycobacteriumtuberculosis, которыеоседаютнадноконтейнерастечениемвремени. НаберитеПАФобъемомравнымобъемуАГвшприцеисоединитесАГ-содержащимшприцем.4. ЭмульгируйтеАГиПАФзасчетпоследовательноговведения/выведениярастворовдообразованияплотногораствора. Дляпроверкиустойчивостиэмульсиивведитееекаплювкаплюводы–стабильная эмульсия не диспергируются при контакте с водой. 5. Переместитевс. ПАФ/АГэмульсиюводиншприциуберитевторойшприцвместескраном, послечеговставьтестерильную 20-Gиглувшприцсэмульсией. Сделайтеинъекциюинтраперитонеальноисследуемомуживотному (Yokoyama, W. M., 2013). 2. 2 Применение МАТ в терапииМеханизм противоопухолевого действия моноклональных антител достаточно сложный и включает следующие элементы:• комплемент-зависимая цитотоксичность,• антителозависимая клеточная цитотоксичность,• индуцирование апоптоза,• ингибирование сигнальной трансдукции,• Аb2 вакцины,• фагоцитоз (только активированные макрофаги),• блокада рецепторов (антирецепторы).Сообщения о первом использовании пассивной иммунотерапии у человека появилось в конце XIX века, когда впервые сыворотка иммунизированных собак и осла была использована для лечения 50 больных со злокачественными опухолями. При этом у некоторых пациентов регистрировалось уменьшение размеров опухоли и клинических симптомов заболевания (Моисеенко В.М., 2003).Действие МАТ на клетку опухоли: 1) МАТ связывает АГ опухолевой клетки, в результате чего либо активируются макрофаги, атакующие опухолевую клетку, либо активируется система комплемента – все это приводит к гибели злокачественной клетки,2) с МАТ может быть связан радиоактивный изотоп, токсин или цитокин, которые вызывают гибель клетки, или же фермент, который превращает препарат в активную форму, 3) биспецифические МАТимеют 2 сайта связывания: сайт связывания опухолевой клетки, и сайт связывания с киллерной эффекторной клеткой,4) МАТ связаны с липосомами, в которых заключен препарат или токсин (Халикова Р. А. и др., 2018).Начало современного этапа использования моноклональных антител в клинической онкологии было положено работами D.Pressman, L.Korngol. Авторами была обоснована идея использования антител для воздействия на опухолевые клетки, в том числе определения локализации метастазов остеогенной саркомы. Широкое использование этого метода было затруднено в связи с технологическими трудностями в получении моноклональных антител в достаточных количествах. Это стало возможным только после революционных работ G.Kohler и C. Milstein, которые разработали рекомбинантную гибридомную технологию получения моноклональных антител. За эту разработку авторы получили Нобелевскую премию. И уже в 1979 г. L.Nadler были пролечены первые больные. С тех пор тысячи больных со злокачественными опухолями получили лечение моноклональными антителами (Будчанов Ю. И., 2012).Рисунок 3 – Терапевтические препараты на основе МАТ, одобренные в США (ReichertJ. M., 2001).Как уже упоминали, первый препарат на базе МАТ (Мабтера) был выпущен рынок в 1997 г., после чего на рынке такие препараты стали появляться с определенной периодичностью где-то 1 препарат в год (Курильников А. Я., 2002; Чмутин Е. Ф., 2009). Наданныймомент 5 препаратовсМАТвходятвтоп 15 лекарствпочислупродаж, этотакиепрепаратыкак Humira®, Remicade®, Avastin®, Rituxan® andHerceptin® (Yagami, H.Etal., 2013). Перспективным направлением применения моноклональных антител является использование их высокой специфичности для целенаправленной доставки какого-либо агента, вызывающего гибель клеток. С этой целью разрабатываются конъюгированные радиофармакологические и токсинконъюгированные препараты, в которых антитело выполняет ключевую роль целенаправленной доставки излучателя или токсина к клеткам, экспрессирующим тот или иной антиген.Области применения моноклональных антител:идентификация субпопуляций лимфоцитов человекаистощение клеточных популяцийвыделение клетокустановление функций молекул клеточной поверхностидиагностика опухолей и локализация опухолейанализ сложных смесей антигенованализ эмбрионального развитияквадромыанализ иммунного ответаискусственные ферментыопределение группы крови (реакция агглютинации – поликлоны анти-А и анти-В применяют для определения агглютиногенов эритроцитов)иммуноферментный анализ (лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител)метод проточной цитометрии (для быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов при помощи флуорхромов – фикоэритрина, флуоресцеина)радиоиммунный анализ методы иммунохроматографиитерапевтические моноклональные антитела (Будчанов Ю. И., 2012; Авдеева Ж. И. и др., 2019).СписоклитературыDe St. Groth, S. F., & Scheidegger, D. (1980). Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics. Journal of Immunological Methods, 35(1-2), 1–21. doi:10.1016/0022-1759(80)90146-5Hnasko, R. M., & Stanker, L. H. (2015). Hybridoma Technology. ELISA, 15–28. doi:10.1007/978-1-4939-2742-5_2Kozbor, D., & Roder, J. C. (1983). The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes. Immunology Today, 4(3), 72–79. doi:10.1016/0167-5699(83)90123-8Reichert, J. M. (2001). Monoclonal antibodies in the clinic. Nature Biotechnology, 19(9), 819–822. doi:10.1038/nbt0901-819Smith, S. A., & Crowe, Jr., J. E. (2015). Use of Human Hybridoma Technology To Isolate Human Monoclonal Antibodies. Microbiology Spectrum, 3(1). doi:10.1128/microbiolspec.aid-0027-2014Yokoyama, W. M., Christensen, M., Santos, G. D., Miller, D., Ho, J., Wu, T., … Neethling, F. A. (2013). Production of Monoclonal Antibodies. Current Protocols in Immunology, 102(1), 2.5.1–2.5.29. doi:10.1002/0471142735.im0205s102 Zhang, C. (2012). Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies. Antibody Methods and Protocols, 117–135. doi:10.1007/978-1-61779-931-0_7Абелев Г. И. ИСТОРИЯ КЛОНАЛЬНО-СЕЛЕКЦИОННОЙ ТЕОРИИ // Природы - №11 – 2002.Абелев Г. И. Моноклональные антитела // Соросовский Образовательный журнал - № 1., С. 1–6 – 1998.Будчанов Ю. И. / Моноклональные антитела. Использование в диагностике заболеваний и лечебные моноклональные антитела. Методические рекомендации для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов. // Ю.И.Будчанов. - Тверь. - 22 с. - 2012г.Моисеенко В.М. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ // ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ - Т. 4, № 3 – 2003.Pirofski, L., Casadevall, A., Rodriguez, L. et al. Current state of the hybridoma technology. J Clin Immunol 10, 5S–14S (1990). https://doi.org/10.1007/BF00918686Yagami, H., Kato, H., Tsumoto, K., & Tomita, M. (2013). Monoclonal antibodies based on hybridoma technology. Pharmaceutical Patent Analyst, 2(2), 249–263. doi:10.4155/ppa.13.2Levene, A. P., Singh, G., & Palmieri, C. (2005). Therapeutic Monoclonal Antibodies in Oncology. Journal of the Royal Society of Medicine, 98(4), 146–152. doi:10.1177/014107680509800403 Чмутин Е. Ф. Разработка терапевтических моноклональных антител для онкологии: достижения и перспективы / Е. Ф. Чмутин, П. К. Иванов, А. С. Гриневич // Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – №3, Т 8. – С. 27-38. Толькова Е. С. Получение моноклональных антител // Междунар. науч.-иссл. журнал. : Екб. – 2015. – №6 (37). – С. 36-40.Халикова РА, Шафикова МР, Нуркатова НЕ. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. Международный студенческий научный вестник. 2018(4-3):499-501.Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Киселевский М.В., Бондарев В.П. ПРЕПАРАТЫ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ОНКОЛОГИИ. Российский иммунологический журнал. 2019;22(2-1):133-135.Самохвалова В. Р. СОВРЕМЕННЫЙ ВЗГЛЯД НА ДИАГНОСТИКУ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ // INTERNATIONAL STUDENT RESEARCH BULLETIN. – 2018. – №4. – С. 488-491. Курильников А. Я. МАБТЕРА - ПЕРВЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ // Современная онкология : М. – 2002. – №1, Т. 4. – С. 33-35.