Иммуноферментный анализ

Введение маркера в молекулу антигена - один из наиболее распространенных подходов в методах гомогенного иммуноферментного анализа. Все гомогенные методы конкурентоспособны и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемых и меченых антигенов. После образования соответствующего иммунохимического комплекса в растворе измеряется ферментативная активность, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.Антитело, образуя комплекс с антигеном, подавляет активность связанного фермента. Комплекс Аг-Е, подобно свободному E, катализирует превращение субстрата S в продукт реакции P: S ---- P, тогда как комплекс Ат-Аг-Е теряет активность: S ----* P Потеря активности может быть вызвана изменением конформации молекулы фермента, что приводит к нарушению структуры ее активного центра. Другая причина заключается в том, что фермент не может проявлять активность, поскольку антитело блокирует доступ субстрата к активному центру фермента.Если добавить свободный антиген, то он, конкурируя за Ат, вызывает регенерацию Аг-Е и появляется активность фермента: а(Ат-Аг-Е) + bАг = с(Ат-Аг-Е) + d(Ат-Аг) + е(Аг-E) + fAгЕсли имеется стандартная кривая, построенная с использованием известных концентраций меченого и немеченого антигена (график будет представлять линейную зависимость между концентрацией Ag и ферментативной активностью Ag-E), этот метод (конкурентный и гомогенный ELISA) может определить концентрацию антигена в исследуемом образце.Наряду с ферментами в качестве маркеров в гомогенном ИФА могут использоваться модуляторы ферментов (М) - вещества, которые могут подавлять или стимулировать активность ферментов:Ат + (Аг-М-Е)= (Ат-Аг-М-Е), Ат + Аг =(Ат-Аг), S ---- P, S ----* P Комплекс Ar-M-E каталитически активен, но, будучи связанным с Ab, он не может катализировать реакцию. Свободный Ag, присутствующий в тестируемом образце, конкурирующий с Ag-ME за связывание с Ab, добавленным в ограниченном количестве, приводит к увеличению концентрации Ag-ME и, таким образом, способствует ферментативной реакции. Это вариант позитивного модулятора ферментов. Напротив, с отрицательным модулятором активность фермента будет снижаться по мере увеличения свободного Ar в исследуемом образце.Есть много других модификаций гомогенного ИФА. Мы можем привести еще три: - использование простетической группы ферментов, ковалентно связанных с Ar, в качестве маркера;- использование комплексов флуорогенных (S) субстратов фермента с Ar (в отличие от Ar-S, комплекс Ab-Ar-S не может служить субстратом для фермента, в результате ферментативной реакции образуется высоко флуоресцентный продукт сформирован);- использование антител, которые, связываясь с активным центром фермента, подавляют его активность.Время, в течение которого проводится гомогенный тест ELISA, не превышает 5 минут. Хотя гомогенный тест ELISA является быстрым и трудоемким, он имеет более низкую чувствительность по сравнению с гетерогенным тестом ELISA.ЗаключениеЧувствительность ELISA такова, что определение веществ в концентрациях 1,0-0,001 нМ или микрограмм-нанограмм белка в 1 мл является обычным явлением. Подобно тому, как человеческий глаз регистрирует единичный квант света, ELISA может быть улучшен для обнаружения отдельных молекул аналита с использованием систем каскадного усиления. Возможности повышения чувствительности ограничиваются фоновым шумом анализируемого соединения (т.е. его присутствие не только в анализируемом образце, но также в используемых реагентах и растворителях), специфичностью ферментного субстрата и аффинностью антител.Ограничения ELISA также включают присутствие кофакторов, ингибиторов и усилителей активности ферментов в исследуемых образцах. Другой недостаток заключается в том, что ELISA не позволяет отличить нативные белки от их биологически неактивных фрагментов, которые сохранили антигенные детерминанты.Изменения каталитической активности фермента при конъюгировании с антигеном могут мешать ИФА. Ограничением ELISA является его применимость только к хорошо изученным системам, в которых присутствуют очищенные антигены и высокоспецифичные антитела.В основном метод используется для диагностики сифилиса (в сочетании с другими реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Он имеет ограниченную ценность для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Метод ИФА также используется для определения антител к различным инфекционным заболеваниям, уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний, возможно определение иммуноглобулинов (вид, подклассы, специфичность), а также идентификации субпопуляций лимфоцитов.Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может дать неверные результаты. Ложноположительные результаты могут быть получены из-за ревматоидного фактора, которым является иммуноглобулин M по сравнению с иммуноглобулином G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена веществ или при приеме лекарств; такие ложноположительные реакции могут возникать у новорожденных из-за образования в организме ребенка антител М к материнскому иммуноглобулину G. Ложноотрицательные результаты реакции связаны с конкуренцией между иммуноглобулинами M и G, а также с техническими ошибками при настройке реакции.Список литературыВоробьева, А.А. Иммунология и аллергология. Цветной атлас / под ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова, А.В.Караулова. – М.: Практическая медицина, 2006. – 287 сЕгоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев.– М.: Высшая школа, 1991. -228 с.Иммуноферментный анализ / Ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988Карцова Л.А. (ред.) Проблемы аналитической химии. Том 18. Капиллярный электрофорез Издательство "Наука", 2014. — 438 с.Ковальчук, Л.В. Иммунология. Практикум: моногр. / Л.В. Ковальчук, Г.А. Игнатьева, Л.В. Ганковская. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 c.Полетаев, А.Б. Клиническая и лабораторная иммунология / А.Б. Полетаев. – М.: Медицинское информационное агентство, 2007. – 184 c.Таранова Н.А., Жердев А.В., ДзантиевБ.Б.. Иммунохимические тест-системы для внелабораторной диагностики // Иммунология. – 2014. – Т. 15. – С. 540-564. Титов, Л.П. Иммунология. Терминологический словарь / Л.П. Титов. – М.: Медицинское информационное агентство, 2008. –512 cТутельян В.А. Природные токсины и проблемы биобезопасности // Тез. Док. 2-го съезда токсикологов России. М.: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрава России. -2003. -С. 32-35.Хаитов, Р.М. Иммунология. Учебник для вузов / Р.М. Хаитов. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.–311 с. Хаитов, Р.М. Иммунология: Учебник / Р.М. Хаитов. – 2-е изд. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 528 с. Хаитов, Р.М. Иммунология. Атлас / Р.М.Хаитов, А.А.Ярилин, Б.В.Пинегин. – М.: ГЭОТАР- Медиа, 2011. – 624 с. Хаитов, Р.М. Иммунология / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. –Москва: СИНТЕГ, 2002. –536 c. Хаитов, Р.М. Иммунология. Атлас / Р.М. Хаитов, А.А. Ярилин, Б.В. Пинегин. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 624 c. Чхенкели, В.А. Иммунология. Учебное пособие / В.А. Чхенкели. – М.: Проспект Науки, 2015. – 144 c. Шляхов, Э.Н. Иммунология, иммунодиагностика, иммунопрофилактика инфекционных болезней / Э.Н. Шляхов. – М.: КартяМолдовеняскэ, 1977. – 424 c. Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. –748 с.Di H., Shi L., Shen H., Yan H., Meng H., Li L., et al. Rapid detection of genetically modified ingredients in soybean products by real-time loop-mediated isothermal amplification. J. Food Nutr. Res. 2014; 2(7):363–8. Dzantiev B., Byzova N., Urusov A., Zherdev A. Immunochromatographic methods in food analysis // Trends in analytical chemistry. – 2014. – V. 55. – P. 81-93. Huang X., Chen L., Xu J., Ji H.-F., Zhu S., Chen H. Rapid visual detection of phytase gene in genetically modified maize using loop-mediated isothermal amplification method. Food Chem. 2014; 156:184–9. Turkec A., Lucas S. J., Karacanli B., Baykut A., Yuksel H. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms (GMOs). Food Chem. 2016; 194:399–409.Xie Q., Wu Y., Xiong Q., Xu H., Xiong Y., Liu K. Advantages of fluorescent microspheres compared with colloidal gold as a label in immunochromatographic lateral flow assays // Biosens. Bioelectron. – 2014. – V. 54. – P. 262-265.Zhou D., Guo J., Xu L., Gao S., Lin Q., Wu Q., et al. Establishment and application of a loopmediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane. Sci. Rep. 2014; 4:4912.