Электрофоретические методы разделения и анализа белков
Заказать уникальный реферат- 13 13 страниц
- 17 + 17 источников
- Добавлена 09.09.2021
- Содержание
- Часть работы
- Список литературы
- Вопросы/Ответы
Оглавление
Введение 2
Классификация электрофоретических методов анализа и общие сроки 2
Электрофорез белков 3
Разделение белков по размеру с применением 5
Выбор пористости геля 6
Подготовка белкового препарата 8
Окраска белков в ПААГ 9
Флуоресцентные красители 11
Список литературы 12
Для предотвращения растворения осажденных белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто в смеси с метанолом, который улучшает растворимость красителя. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37-50 0С) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опасность ослабления окраски полос.Теперь для выявления применяют краситель Кумассиярко голубой («Coomassiebrilliantblue», сокращенноСВВ). Этот краситель дает лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпускают в двух модификациях: R-250 i G-250. На рис. 2 приведена формула G-250. Структура СВВR-250 отличается только отсутствием двух метильных групп. Сейчас эти красители выпускают под названиями «PAGE blue 83» и «PAGE blue G-90» соответственно.Рис 2. КумассиG-250Большое количество ароматических кругов в структуре красителей типаСВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в разбавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные растворы, содержащие 9-10% уксусной кислоты и 40-45% метанола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в этой смеси составляет 0.1-0.25%, редко 0.5%. Иногда СВВ R-250 растворяют в 25%, 50% трихлоруксусной кислоты или в смеси, содержащей 10% ТХУ и 25% изопропанола. Примеси, не растворились, необходимо отфильтровать.Продолжительность окраски зависит от толщины и пористости геля и может варьировать от 2-3 до 12 ч. Для ускорения процесса можно окрашивать гель при 37 0С, а ванночку с раствором красителя покачивать. Отмывание от красителя, который не связался с белком, проводят, вымачивая гель в 7.5% уксусной кислоте и 5% метанола. В этих условиях растворимости красителя достаточно для вымывания его свободных молекул, а десорбция его с поверхности белка незначительна. Если электрофорез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7.5% уксусной кислоты и 20% метанола.При окраске соотношение объемов жидкости и геля должно составлять примерно 3: 1, при отмывании - 5: 1 или даже 10: 1 с двумя-тремя изменениями растворителя.Флуоресцентные красителиДанзилхлорид (рис. 3) выпускается в виде двух кристаллических форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70 0С, желтые - при 73 0С. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их поглощения в растворе лежит в области 330-360 нм, флюоресценции - 510 нм. Молярная экстинцияε = 4.3*106.SO2ClРис. 3. Структурная формула данзилхлоридаВ щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток присоединяется к аминокислотам, пептидов и белков, главным образом, за их конечной аминогруппой. При этом его способность флюоресцировать сохраняется.Список литературыDhawan B.C. Textbook of Electrophoresis / Pearl Books, 2008. – 232 pp.Encyclopedia of analytical chemistry. Application, theory and instrumentation / еd. R. A. Meyers. — Wiley, 2000. — 14484 р.Encyclopedia of Separation Science / еd. M. Cooke, C. F. Poole. — Academic Press, 2000. — 4807 p. Ghowsi K. Electrophoresis / InTech Press, 2012. – 234 pp. Karp G. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments/ Wiley and Sons, 2009. –836 pp. Keren D. Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis/ ASCP Press, 2012. – 402 pp.Magdeldin S. Gel Electrophoresis – Principles and Basics/ InTech Press, 2012, - 366 pp. Sheehan D., Tyther R. Two-Dimensional Electrophoresis Protocols (Methods inMolecular Biology) / Springer, 2009. – 250 pp. Spragg S. P. Electrophoresis // Encyclopedia of physical science and technology / еd. R. A. Meyers. — Academic Press, 2001. — Р. 363—405. Westermeier R. Electrophoresis in Practice/ Wiley-VCH, 2001. – 352 pp.Westermeier R. Electrophoresisin Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations / R.Westermeier. – [2nd ed.]. — NewYork : Wiley, 1997. — 331 р. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Веерецкеи. — М. : Мир, 1982. — 355 с.Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика / Пер. сангл. - М.: «Мир», 1991. – 542 с.Камьшников В.С.Справочникпоклинико-биохимическимисследованиям и лабораторной диагностике / М.: Медпресс-информ, 2003.– 911с. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войцицький В.М. Сучасніметодибіохімічнихдосліджень: Учбовийпосібник / К.: «Фітосоціоцентр»,2001.- 424 с.Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л. А. Остерман. — М. : Наука, 1981. — 288 с.Семак И. В. Биохимия белков / И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич. — Минск : БГУ, 2007. — 49 с.
1. Dhawan B.C. Textbook of Electrophoresis / Pearl Books, 2008. – 232 pp.
2. Encyclopedia of analytical chemistry. Application, theory and instrumentation / еd. R. A. Meyers. — Wiley, 2000. — 14484 р.
3. Encyclopedia of Separation Science / еd. M. Cooke, C. F. Poole. — Academic Press, 2000. — 4807 p.
4. Ghowsi K. Electrophoresis / InTech Press, 2012. – 234 pp.
5. Karp G. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments/ Wiley and Sons, 2009. –836 pp.
6. Keren D. Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis/ ASCP Press, 2012. – 402 pp.
7. Magdeldin S. Gel Electrophoresis – Principles and Basics/ InTech Press, 2012, - 366 pp.
8. Sheehan D., Tyther R. Two-Dimensional Electrophoresis Protocols (Methods inMolecular Biology) / Springer, 2009. – 250 pp.
9. Spragg S. P. Electrophoresis // Encyclopedia of physical science and technology / еd. R. A. Meyers. — Academic Press, 2001. — Р. 363—405.
10. Westermeier R. Electrophoresis in Practice/ Wiley-VCH, 2001. – 352 pp.
11. Westermeier R. Electrophoresisin Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations / R.Westermeier. – [2nd ed.]. — NewYork : Wiley, 1997. — 331 р.
12. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Веерецкеи. — М. : Мир, 1982. — 355 с.
13. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика / Пер. сангл. - М.: «Мир», 1991. – 542 с.
14. Камьшников В.С.Справочникпоклинико-биохимическимисследованиям и лабораторной диагностике / М.: Медпресс-информ, 2003.– 911с.
15. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войцицький В.М. Сучасніметодибіохімічнихдосліджень: Учбовийпосібник / К.: «Фітосоціоцентр»,2001.- 424 с.
16. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л. А. Остерман. — М. : Наука, 1981. — 288 с.
17. Семак И. В. Биохимия белков / И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич. — Минск : БГУ, 2007. — 49 с.
Вопрос-ответ:
В чем заключается классификация электрофоретических методов анализа белков?
Классификация электрофоретических методов анализа белков основана на принципе разделения белков и их характеристиках. Методы могут различаться по способу разделения (на основе заряда, размера или аффинности белков), типу использованной среды (полиакриламидный гель, гелеобразующий полимер и т.д.) и применяемому источнику электрического поля (постоянное или переменное напряжение).
Как работает электрофорез белков?
Электрофорез белков основан на их разделении по заряду и размеру в электрическом поле. Белки имеют заряд, который можно использовать для их разделения. Во время электрофореза, белки перемещаются в электрическом поле к электроду противоположного заряда. Белки могут быть разделены на основе своего размера, так как белки большего размера перемещаются медленнее по гелю, чем белки меньшего размера. Эта разница в скорости движения позволяет разделить белки на полиакриламидных гелях.
Как выбрать пористость геля при разделении белков по размеру?
Выбор пористости геля зависит от размера белков, которые нужно разделить. Для разделения малых белков (меньше 10 кДа) рекомендуется использовать гель с высокой пористостью, так как такие белки проходят через поры легче и быстрее. Для разделения больших белков (больше 100 кДа) лучше использовать гель с низкой пористостью для более эффективного разделения.
Как провести подготовку белкового препарата для электрофореза?
Подготовка белкового препарата для электрофореза включает несколько шагов. Сначала необходимо отделить белки от других компонентов образца, например, удалить жиры или нуклеиновые кислоты при помощи осаждения или фильтрации. Затем белки обычно денатурируются, то есть разрушается их пространственная структура, чтобы они легче образовывали комплексы с окрашивающим веществом и удаление сворачиваются при окраске.
Какие электрофоретические методы используются для анализа и разделения белков?
Электрофоретические методы, используемые для анализа и разделения белков, включают полиакриламидный гель-электрофорез (ПААГ), изоэлектрическую фокусировку, двумерный электрофорез и геле-электрофорез.
Как происходит электрофорез белков?
Электрофорез белков основан на их заряде и размере. Во время электрофореза, белки разделяются в электрическом поле в зависимости от их заряда и размера. Белки с положительным зарядом будут двигаться к отрицательному электроду, а белки с отрицательным зарядом - к положительному электроду. Белки разделяются на основе их скорости миграции и молярной массы.
Как выбрать пористость геля при разделении белков?
Выбор пористости геля зависит от размера белков, которые вы хотите разделить. Для разделения малых белков используются гели с более высокой пористостью, а для разделения больших белков - гели с более низкой пористостью. Пористость геля может быть изменена путем изменения концентрации акриламида в геле.
Какие методы подготовки белкового препарата используются перед электрофорезом?
Перед проведением электрофореза белков необходимо выполнить некоторые этапы подготовки препарата. Это может включать денатурацию белков, удаление липидов и РНК, концентрирование препарата и добавление буферных растворов для создания подходящих условий для электрофореза.
Какие красители часто используют для окрашивания белков в ПААГ?
Для окрашивания белков в ПААГ часто используются флуоресцентные красители, такие как кумазен (Coomassie Brilliant Blue), синий серебра (silver stain) и флуоресцеин (Fluorescein). Они позволяют визуализировать белки и обнаружить их на геле после электрофореза.
Какие методы классификации электрофореза белков существуют?
Существует несколько методов классификации электрофореза белков. Один из них основан на модификации напряженности электрического поля и может включать горизонтальный, вертикальный, изоэлектрический фокусированный, агарозный или полиакриламидный гель-электрофорез. Другой метод классификации основан на миграции частиц и может включать агарозный гель-электрофорез, полиакриламидный гель-электрофорез, микрофлюидный электрофорез и капилярный электрофорез.
Как осуществляется разделение белков по размеру с помощью электрофореза?
Для разделения белков по размеру с помощью электрофореза используют гель-электрофорез. Препарат наносится на гель и затем подвергается воздействию электрического поля. Факторы, такие как размер, форма и заряд белка, определяют его скорость миграции через гель. Белки разделяются по размеру на основе их скорости миграции: крупные белки мигрируют медленнее, а мелкие белки мигрируют быстрее.
Как подготовить белковый препарат для электрофореза?
Подготовка белкового препарата для электрофореза включает несколько этапов. Сначала требуется извлечение белков из образца с использованием соответствующих методов извлечения. Затем производится очистка препарата от нежелательных примесей, таких как липиды и нуклеиновые кислоты. Для этого применяются методы, такие как осаждение, фильтрация и центрифугирование. После очистки препарат может быть окрашен или подвергнут другим методам анализа.