Методы сборки генетических конструкций

Первоначально в ПЦР использовался фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli, что было крайне неудобно по нескольким причинам. Основные из них: необходимость добавления фермента в реакционную смесь после каждого отжига, так как она денатурирована; и большое количество неспецифических продуктов реакции из-за низкой температуры удлинения цепи ДНК, оптимальной для фермента, на которой образуются сайты посадки альтернативных праймеров.Следовательно, специфичность ПЦР в данном контексте была недостаточной. Использование ДНК-полимераз, выделенных из термофильных бактерий, позволило устранить указанные выше недостатки, поскольку такие ферменты обладают высокой термической стабильностью и высокой температурой, оптимальной для проявления максимальной активности (70-75 С).Самым известным термофильным ферментом и исторически первым, используемым в ПЦР, является Taq-ДНК-полимераза Thermusaquaticus. (Saikietal., 1988). Этот фермент впервые был описан в 1976 г., но так и не был востребован вплоть до наступления эпохи ПЦР (Chienetal., 1976). В настоящее время в арсенале генетической инженерии имеется целый спектр термофильных полимераз, в том числе и рекомбинантных, обладающих различными дополнительными активностями, скоростью синтеза цепей ДНК, точностью копирования матричной ДНК и т.д. Особо важным этапом в развитии и внедрении ПЦР в различные области науки и медицины следует признать выделение термостабильных ДНК-полимераз (например, Pfu-ДНК-полимераза Pyrococcusfuriosus, Tth-ДНК-полимераза Thermusthermophiles), обладающих высокой корректирующей активностью (3'–>5' экзонуклеазная активность), которой лишена Taq-ДНК-полимераза. Сегодня ПЦР является, пожалуй, основным инструментом не только генной инженерии в ее классическом понимании, но также активно используется при генотипировании различных организмов, в том числе в судебной медицине и установлении отцовства, в диагностических инструментах и ​​наборах для заболеваний различной этиологии. , идентификация онкомаркеров и др., генетические аномалии до начала заболевания.Для научных исследований важность CRP трудно переоценить. Благодаря развитию этого метода в арсенале молекулярных биологов, вирусологов, биотехнологов, иммунологов и ученых из других областей науки появились новые высокоэффективные инструменты. Просто назовите новые методы, такие как ОТ-ПЦР (ПЦР после получения кДНК в матрице РНК с использованием обратной транскриптазы), мультиплексный ПЦР-анализ (исследование нескольких генетических локусов в реакционной смеси одновременно), ПЦР в реальном времени (позволяет количественно оценить оценка матрицы, содержащейся в образце, и накопление продукта ПЦР в каждом цикле).С использованием ПЦР стал возможен новый метод химико-ферментативного синтеза генов, который не требует синтеза больших количеств олигомеров для многостадийной сборки целевого гена. Частично перекрывающиеся полинуклеотиды могут быть эффективно увеличены с помощью метода ПЦР, а количество перекрытий и, следовательно, удлинения продукта ПЦР теоретически могут быть любыми. На последнем этапе обычно конечный целевой фрагмент ДНК (ген) получают тем же методом с использованием концевых праймеров. П. Диллон и К. Розен первыми применили метод ПЦР для синтеза химико-ферментативных генов. Авторы перекрыли ген rev ВИЧ-2 с четырьмя полинуклеотидами длиной 105 единиц каждый, и сами полинуклеотиды также имели попарное перекрытие, образуя дуплексы 20-25 п.н., которые действовали как праймеры в ПЦР.На первом этапе использовали полинуклеотиды A, B, C, D, на втором - короткие концевые праймеры E и F. Таким образом, был получен и клонирован целевой ген длиной 300 п.н. Авторы успешно применили тот же подход к синтезу и мутагенезу других генов.Впоследствии многие исследователи использовали различные подходы к ферментативному химическому синтезу с использованием ПЦР, который можно назвать безматричным синтезом генов, что означает, что реакция не имеет традиционной ДНК-матрицы, а сами химически синтезированные полинуклеотиды играют свою роль.ЗаключениеМетоды редактирования генома, разработанные в последние годы, представляют собой развитие подходов к генной терапии, существующих с начала прошлого века. Однако можно с уверенностью сказать, что сегодня мы являемся свидетелями смены парадигмы в области геномной медицины.В начале второго десятилетия 21 века. Одновременно произошло несколько технологических прорывов, имеющих мощный синергетический эффект: улучшение технологий прямой дифференциации клеток, значительное снижение стоимости и рутинного использования геномных секвенаторов, а также создание систем редактирования генома.Все это неизбежно приведет к появлению нового качества персонализированной геномной медицины в ближайшие 3-5 лет. Геномные технологии станут рутинным инструментом для клиницистов.Опережающее развитие принципиально новых технологий в медицине не позволяет законодателю работать над правовыми основами их использования так же, как и раньше. Теперь пришло время изменить парадигму законодательного регулирования распространения новых медицинских технологий из исследовательской лаборатории в клинику. Глобализация привела к тому, что инновации распространяются по миру буквально со скоростью света. Перспективные новые медицинские технологии, где бы они ни создавались, неизбежно находят развитие и используются в основном в странах с более гибким или более либеральным законодательством.Эти государства получают «фору» благодаря раннему внедрению инновационных подходов, даже с учетом присущих им рисков. Многие законодательные ограничения на переход «от науки к медицине» в отдельных странах не имеют смысла, поскольку технологии, созданные в этих странах, рано или поздно попадают в «научный офшор», откуда они быстро распространяются по всему миру. мира, а также привлекают клиентов на «офшорных» территориях. Некоторые страны изначально пытаются запретить использование систем редактирования генома человека с использованием «дизайнерских» нуклеаз, но вынуждены быстро менять позиции, чтобы не оказаться в хвосте технологических лидеров. После публикации в 2015 году работы китайских авторов по редактированию генома человеческих эмбрионов с помощью CRISPR / Cas9 в феврале 2016 года группе британских ученых было разрешено генетически модифицировать человеческие эмбрионы с использованием CRISPR / Cas9 и связанных с ними нуклеаз дизайна.Общественное мнение в контексте внедрения технологий в некоторых юрисдикциях быстро меняется и начинает оказывать давление на собственные законодательные нормы.Список литературыЗелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractiscrispa с болевым ваниллоидным рецептором ТRPV1: insilico исследование // Биоорг. химия. 2012. Т. 38. C. 185–198.КозловС.А., АндреевЯ.А., МурашевА.Н., СкобцовД.И., ДьяченкоИ.А., ГришинЕ.В. Новыеполипептидныекомпонентысанальгетическойактивностьюизморскойанемоны Heteractis crispa // Биоорг. химия. 2009. Т. 35. С. 789–798.Юрьев А.Г. Генетические алгоритмы оптимизации строительных конструкций / А.Г. Юрьев, С.В. Клюев // Образование, наука, производство и управление в XXI веке: матер. Междунар. науч. конф. В 4 т. – Ст. Оскол: Изд-во СТИ МИСиС, 2004. – Т. 4. – С. 238 – 240. Юрьев А.Г. Эволюционные и генетические алгоритмы оптимизации строительных конструкций / А.Г. Юрьев, С.В. Клюев. – Белгород: Изд-во БГТУ им. В.Г. Шухова, 2006. – 134 с. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV) / V.L. De Oliveira, S.C. Almeida, H.R. Soareset al. // Arch. Virol. -2011. - Vol. 156. - P. 597-609. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007–2012 / A. Gogin, V. Gerasimov, A. Malogolovkin et al. // Virus Res. - 2013. - Vol. 173. - P. 198-203. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007 / R.J. Rowlands, V. Michaud, L. Heath et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 14. - P. 1870-1874. Correia, S. Identification and utility of innate immune system evasion mechanisms of ASFV / S. Correia, S. Ventura, R.M. Parkhouse // Virus Res. - 2013. - Vol. 173. - P. 87-100.Di H., Shi L., Shen H., Yan H., Meng H., Li L., et al. Rapid detection of genetically modified ingredients in soybean products by real-time loop-mediated isothermal amplification. J. Food Nutr. Res. 2014; 2(7):363–8. Dzantiev B., Byzova N., Urusov A., Zherdev A. Immunochromatographic methods in food analysis // Trends in analytical chemistry. – 2014. – V. 55. – P. 81-93.Eshelman L.J. Biases in the Crossover Landscape: Technical report / L.J. Eshelman, R.A. Caruana, J.D. Schaffer. – New York: Philips Laboratories, North American Philips Corporation, 1989. – 10 p. Galindo, I. African Swine Fever Virus: A Review / I. Galindo, C. Alonso // Viruses. - 2017. - Vol. 9. -P. 103. Granja, A.G. A238L inhibits NF-ATc2, NF-kappa B, and c-Jun activation through a novel mechanism involving protein kinase C-theta-mediated up-regulation of the amino-terminal transactivation domain of p300 / A.G. Granja, N.D. Perkins, Y. Revilla // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. - P. 2429-2442. Huang X., Chen L., Xu J., Ji H.-F., Zhu S., Chen H. Rapid visual detection of phytase gene in genetically modified maize using loop-mediated isothermal amplification method. Food Chem. 2014; 156:184–9. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunization / K. King, D. Chapman, J.M. Argilaguet et al. // Vaccine. - 2011. - Vol. 29. - P. 4593-4600. Review of the sylvatic cycle of African swine fever in sub-Saharan Africa and the Indian Ocean / F. Jori, L. Vial, M.L. Penrithet al. // Virus Res. – 2013. - Vol. 173. - P. 212-227.Riedel J. Genetikals alternative Optimierungsstrategies / J. Riedel // 4. Institutskolloquium, Bauhaus – Universitat Weimar: Bericht 3/98, Institut fur Strukturmechanik. – Weimar: Bauhaus – Universitat, 1998. – S.19 – 33.Turkec A., Lucas S. J., Karacanli B., Baykut A., Yuksel H. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms (GMOs). Food Chem. 2016; 194:399–409.Xie Q., Wu Y., Xiong Q., Xu H., Xiong Y., Liu K. Advantages of fluorescent microspheres compared with colloidal gold as a label in immunochromatographic lateral flow assays // Biosens. Bioelectron. – 2014. – V. 54. – P. 262-265.Zhou D., Guo J., Xu L., Gao S., Lin Q., Wu Q., et al. Establishment and application of a loopmediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane. Sci. Rep. 2014; 4:4912.