Классификация ДНК-векторов и способов их введения в клетки. Химическая трансформация бактериальных клеток

Лентивирусы относятся к семейству ретровирусов и в отличие от других ретровирусов инфицируют не только делящиеся, но и неделящиеся клетки. Наиболее исследованным лентивирусом является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В связи со способностью лентивирусов включать большое количество генетического материала (до 8 тыс. пар оснований) и инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки, эти вирусы являются перспективным вектором для доставки генов в условиях in vivo. Эта способность обеспечивается взаимодействием вирусного преинтеграционного комплекса с ядерной оболочкой и транспортом через нее. Сборка лентивирусного вектора происходит в упаковывающих клетках — это перевиваемые клетки, осуществляющие синтез вирусоспецифических белков. Упаковывающие клетки включают в себя пакующую, векторную и оболочечную кассеты, которые вместе позволяют собрать функциональную вирусную частицу. При этом их одновременная экспрессия не вызывает образования ретровирусных частиц, способных инициировать инфекционный процесс у человека. Лентивирусы имеют сравнительно небольшой объем вставки целевого гена (до 8 тыс. пар оснований), могут обеспечить длительную экспрессию трансгена и индуцируют минимальный иммунный ответ организма-хозяина. Лентивирусные векторы, псевдотипированные с гликопротеинами оболочки вируса бешенства (PV-штамм), приобретают тропность к нейрональной ткани и способность к ретроградному транспорту в условиях in vivo. Введенный в периферическом участке нервной системы псевдотипированный лентивирусный вектор по нейрональным аксонам доставил трансгены в ЦНС.3) Векторные системы на основе аденовирусов Аденовирусы — семейство ДНК-вирусов, несущих в своем составе одну двуцепочечную молекулу ДНК и лишенных липидной оболочки. Для целей генной терапии используют геномы аденовирусов группы С серотипов 2 и 5, не обладающих онкогенным потенциалом. Геном аденовирусов представляет собой линейную двунитевую ДНК размером до 36 т.п.о.Рисунок 5 – Структурная организация генома аденовирусовПримечание: Е1 - область, критическая для трансформации, Е1А - регулятор транскрипции, Е1В - кодирует трансформирующий антиген, связывающий клеточный белок р53, Е2В - кодирует ДНКполимеразу, Е2А - кодирует ДНК-связывающий белок, Е3 - кодирует продукты, необходимые для репликации и взаимодействующие с молекулами HLA I класса, Е4 - кодирует продукты, взаимодействующие с ядерным матриксом, ITR - инвертированные концевые повторы »100 п.н.Аденовирусы, дефектные по репликации, получали за счет замены гена Е1, необходимого для репликации, на ген интереса, промотор и энхансер. При этом такие рекомбинантные векторы эффективно размножаются в пакующих клетках, экспрессирующих продукт гена Е1. Проводят котрансфекцию таких клеток двумя фрагментами ДНК генома аденовируса, общая длина которых составляла 100 единиц (локусов) картирования. Один из фрагментов (0-17 локусы), в котором Е1-область заменена терапевтическим геном, был встроен в челночный вектор на основе плазмиды E. coli и фланкирован нуклеотидными последовательностями аденовируса. Второй фрагмент представлял собой усеченную молекулу ДНК аденовируса, лишенную первых восьми локусов, включающих Е1-ген. Этот фрагмент имеет перекрывающийся участок с плазмидой, несущей терапевтический ген. После введения этих фрагментов ДНК в клетки-мишени в результате их рекомбинации происходит восстановление полноразмерной аденовирусной ДНК, в которой вместо Е1- области находится терапевтический ген. Далее химерный геном упаковывается в оболочку аденовируса и рекомбинантный аденовирус используется для инфицирования клетки-мишени. ДНК вируса проникает в ядро, где происходит экспрессия терапевтического гена.Рекомбинантные аденовирусные векторы обеспечивают очень высокую экспрессию клонированных генов, но на короткое время (5–10 сут) — из-за иммунного ответа организма-реципиента. Аденовирусы способны инфицировать большинство типов клеток (делящиеся и неделящиеся). Объем для вставки целевого гена составляет 20 тыс. пар оснований, что является достаточно большой емкостью рекомбинантных аденовирусных векторов. Аденовирусы реплицируются в ядре инфицированной клетки как эписомные элементы и обладают высокой эффективностью трансдукции.4) Вирусные векторы на основе вируса простого герпеса (herpes simplex virus, HSV)Геном HSV-1 представлен двухцепочечной ДНК размером 152 т.п.н. Такой большой размер генома затрудняет генетические манипуляции с ним. Для решения этой проблемы сконструирован челночный вектор, включающий последовательности плазмиды кишечной палочки и «усеченный» геном HSV, состоящий из нуклеотидных последовательностей, ответственных за начало репликации и упаковку вирусных частиц. Такие векторы имеют конструкцию проще, чем векторы на основе аденовирусов. Сам вирус включает около 80 генов, один из которых (IE3) чаще всего замещается при создании вектора. Исключены могут быть и другие гены, что позволяет увеличить объем вектора или заклонировать несколько генов интереса. Недостатками векторов на основе вирусов простого герпеса являются кратковременная экспрессия клонированных генов, токсичность для клеток-мишеней, низкая эффективность трансдукции и способность заражать только неделящиеся клетки. Для создания вирусных векторов сейчас активно используются ампликоны — многократно повторяющиеся последовательности вируса простого герпеса, которые включают мономерные последовательности, организованные как конкатемеры. Каждый мономер включает хотя бы один участок начала репликации вирусной ДНК (oriS или oriL) и последовательность для упаковки ДНК в вирусную частицу (pac). Молекулярное клонирование этих последовательностей в бактериальную плазмиду позволяет получить вектор, который упаковывает ДНК в вирион HSV. Такие векторные системы способны включать до 150 тыс. пар оснований чужеродной ДНК, что предоставляет возможность одним вектором доставлять в клеткумишень несколько транскрипционных единиц, не вызывая при этом иммунного ответа и цитопатического эффекта. Вирусы простого герпеса — нейротрофичны и высокоэффективны при изучении ретроградного и антероградного транспорта в ЦНС, могут быть введены в неопасном латентном состоянии. HSV-векторы имеют большую генетическую емкость и могут обеспечить долгосрочную экспрессию трансгена, однако, как отмечалось выше, основным недостатком их являются токсичность для клеток и низкая эффективность трансдукции. 5) Векторные системы на основе поксвирусовПоксвирусы — крупные вирусы, которые содержат двунитевую ДНК. Поксвирусный вектор позволяет включить до 25 тыс. пар нуклеотидов ДНК интереса без исключения генов самого вируса. Векторные системы на основе поксвирусов не имеют такого широкого применения, поскольку эукариотические промоторы неэффективно распознаются транскрипционными механизмами поксвирусов и для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в клетке-реципиенте нужно использовать поксвирусные промоторы. Поксвирусные транскрипты не подвергаются сплайсингу, из-за чего ДНК интереса обязательно должна быть представлена в форме комплементарной ДНК. Особенностью жизненного цикла поксвирусов является наличие собственной ДНК-зависимой РНКполимеразы, которая обеспечивает считывание более половины вирусного генома в течение начальной и ранней стадий репродуктивного цикла. Вследствие большого размера и неинфекционной природы поксвирусной ДНК чужеродные гены клонируются в поксвирусах путем рекомбинации в условиях in vivo. Поксвирусы обладают природным тропизмом к опухолевой ткани. Главными недостатками поксвирусов являются высокая иммуногенность, кратковременная продолжительность экспрессии и сложности репликации в эукариотических клетках. При этом положительными сторонами поксвирусов служат высокая эффективность трансдукции, емкость и способность заражать большинство типов клеток.6) Векторы на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусовРекомбинантные аденоассоциированные вирусы (рААВ) являются одними из наиболее перспективных векторов доставки для генной терапии и нейробиологии благодаря своим непатогенным свойствам, низкой иммуногенности со стороны хозяина, тропности к большинству клеток и тканей, высокой эффективности трансдукции и продолжительной экспрессии. Аденоассоциированный вирус (ААВ) — это небольшой, непатогенный для человека вирус, геном которого представляет одноцепочечную ДНК размером 4,68 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н). Для продуктивной инфекции ААВ необходимы белки вирусов-помощников, например аденовирусов. При инфекции клеток ААВ попадает в ядро, его геном с помощью полимераз клетки-хозяина преобразуется в двухцепочечную ДНК и интегрирует с геномом клетки-мишени. Основной их недостаток — небольшая емкость вектора. Для доставки в клетку они прикрепляются к мембране клетки, связываясь с рецептором, после чего начинается интернализация вектора, его внутриклеточный транспорт и наконец интеграция с геномом клетки-хозяина, после чего запускается процесс репликации.Рисунок 6 – Жизненный цикл аденоассоциированого вируса ААВ2Рекомбинантный ААВ получают с помощью котрансфекции клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником, двумя плазмидами. Одна из них несет терапевтический ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами длиной 125 т.п.н. ААВ, а вторая (хэлперная) - два его гена, rep и cap, ответственных за репликацию генома и синтез белка 27 капсида. Как следствие, клетки производят не только ААВ, но и аденовирусы, которые загрязняют конечный продукт. Хелперная плазмида, или плазмида-помощник, обладает одной или несколькими функциями, которые отсутствуют у дефектной плазмиды. После лизиса инфицированных клеток рекомбинантные ААВ отделяют от вирусов-помощников с помощью центрифугирования и диализа. Эти векторы могут нести ДНК-вставку размером до 4,5 т.п.н, не вызывают развитие иммунного ответа, т.к. не содержат генов ААВ.Рисунок 7 – Хэлперная плазмида pDG.2.2.2 Невирусные векторыИспользование «голых» ДНК-молекул, кодирующих гены, малоэффективно, т.к. защитные механизмы клетки ограждают ее от внедрения чужеродного генетического материала. Таккаквирусныевекторывсеещепредставляютнекуюопасностьвследствиесвоейинфекционности, перспективнымсчитаетсясозданиетакихреплицирующихсяэписомальных векторов, которые состоят только из функционирующих хромосомных элементов. Одним из таких векторов являются конструкции на основе настоящих хромосом. Искусственныехромосомыпозволяютподдерживатьчислокопий гена в клетке на стабильном уровне и имеют бесконечную способность к саморепродукции. Хромосомысоставленыиз 3 основныхчастей: центромера, теломерыиоснова. Первыеискусственныехромосомы (ИХ)человекабылинеустойчивы и при встраивании в геном вызывали перестройки в хост-клетке. ОднакоИХ, созданныеEbersoleидр., где замкнутые в кольцо ИХ были более стабильны. АвысокаяспособностьИХмлекопитающих (ИХМ) кклонированиюпозволяет доставить целую хромосому со всем необходимым для нее материалом в клетку. Существует 2 подходаксозданиюИХ: «сверху-вниз», когданастоящую хромосому укорачивают за счет иррадиации фрагментации теломер, получая минихромосомы, а при создании «снизу-вверх» методом длинные сателлитные последовательности ДНК комбинируют с теломерной ДНК и w100-кб фрагментами геномной ДНК. СписоклитературыCOHEN S. N. Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro / S. N. COHEN, A.C. Y. CHANG, H. W. BOYER, R. B. HELLING // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1973. – Vol. 70, No. 11 – P. 3240-3244 Ebersole, T. A., Ross, A., Clark, E., McGill, N., Schindelhauer, D., Cooke, H., et al. (2000). Mammalian artificial chromosome formation from circular alphoid input DNA does not require telomere repeats. Human Molecular Genetics, 9(11), 1623–1631.LEDERBERG, J., & TATUM, E. L. (1946). Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature, 158(4016), 558–558. doi:10.1038/158558a0Lorenz MG, Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev. 1994;58(3):563-602. doi:10.1128/mr.58.3.563-602.1994Malik, V. S. (1981). Recombinant DNA Technology // Advances in Applied Microbiology – 1981. – Vol.27 – P. 1–84. Wirth T. History of gene therapy / T. Wirth, N. Parker, Ylä-Herttuala S. // Gene – 2013. – Vol. 525(2) – 162–169.`Wirth, R., Friesenegger, A., & Fiedler, S. (1989). Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation. MGG Molecular & General Genetics, 216(1), 175–177. doi:10.1007/bf00332248Wong, S. P., Argyros, O., & Harbottle, R. P. (2015). Sustained Expression from DNA Vectors. Advances in Genetics, 113–152. doi:10.1016/bs.adgen.2014.11.00Епифанова Е.А. Вирусные векторы для доставки генетического материала в клетку и их использование в нейробиологии / // СТМ – 2017. — Т. 9, №1.Жидкин, Р. Р. Развитие подходов к трансформации бактериальных клеток плазмидной ДНК / Р. Р. Жидкин, А. А. Пустовалова, О. К. Давыдова // Оренбургские горизонты: прошлое, настоящее, будущее : сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 275-летию Оренбург. губернии и 85-летию Оренбург. обл., 21-22 нояб. 2019 г., Оренбург / Правительство Оренбург. обл., М-во образования Оренбург. обл., Федер. гос. бюджет. образоват. учреждение высш. образования "Оренбург. гос. ун-т"; гл. ред. А. С. Боровский. - Электрон. дан. - Оренбург : Фронтир,2019. - . - С. 311-314. . - 4 с.Супотницкий М.В. Генотерапевтические векторные системы на основе вирусов // Биопрепараты. – 2011. – № 3. – С. 15–26.