Электроблоттинг белков
Заказать уникальный реферат- 17 17 страниц
- 9 + 9 источников
- Добавлена 13.09.2021
- Содержание
- Часть работы
- Список литературы
- Вопросы/Ответы
Введение 3
1. Блоттинг белков 4
2. Метод переноса белков на мембрану - электроблоттинг 9
Заключение 15
Литература 17
При увеличении тока в 10 и более раз по всей поверхности сэндвича эффективность переноса, эквивалентная методам резервуара и полусухого, может быть достигнута всего за 5–10 м.
Перенос белка с использованием экспресс-блоттинга Pierce ™ G2 по сравнению с традиционным танковым методом.
Лизат HeLa (~ 3, 0 мг / мл), полученный азотной кавитацией, последовательно разбавляли 1: 2, готовили для SDS-PAGE и разделяли на гелях в соответствии с рекомендациями поставщиков. Затем белки переносили из геля в мембрану, используя различные методы.
Для электроблоттинга с помощью быстрого блоттера Pierce ™ G2 гели, фильтровальную бумагу, предварительно смоченные одноступенчатым буфером переноса Thermo Scientific ™ Pierce ™, и мембраны собирали в кассету для быстрого блоттера Pierce ™ G2 в соответствии с указаниями. Кассета была помещена в блок управления быстрым блоттером Pierce ™ G2, и белки были перенесены с использованием предварительно запрограммированного метода «High MW» для 1 минигеля (постоянная 1, 3 ампер, предел 25 вольт, 10 м).
Условия передачи затем выбираются с помощью сенсорной панели на устройстве.
Для традиционной переноски в течение ночи гели, фильтровальную бумагу и мембрану уравновешивали в холодном буфере Towbin 1 (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол) в течение 15 минут. Сэндвич переноса был собран в коммерчески доступном резервуаре, и постоянная 30 В применялась в течение 16 часов при 4 ° C.
Иммунологический
Получающиеся в результате мембраны из двух способов переноса были разрезаны на треть. Верхние срезы исследовали либо антителом Thermo Scientific ™ против mTOR (продукт № PA1-518), либо антителом Thermo Scientific ™ против Ecm29 (продукт № PA3-035). Средние срезы зондировали антителом Thermo Scientific ™ против PLK1 (продукт # MA1-848), тогда как нижние части зондировали антителом Thermo Scientific ™ против циклофилина B (продукт # PA1-027A). [1]
Антитела разводили в быстром блокирующем буфере Thermo Scientific ™ Pierce (продукт № 37575). Затем мембраны обрабатывали с использованием наборов Fast Western Scientific Blot, Thermo Scientific ™ Pierce ™, наборов SuperSignal ™ West Dura (продукт № 35075 (мышь) и № 35076 (кролик)). Затем полученные блоты были одновременно визуализированы с использованием тепловизора Thermo Scientific ™ MYECL ™ (продукт № 62236).
Fast Blotter Pierce ™ G2 в сочетании с 1-ступенчатым буфером переноса Pierce ™ обеспечивает высокоэффективный перенос белков с низкой, средней и высокой молекулярной массой из полиакриламидных гелей в нитроцеллюлозные или PVDF-мембраны всего за 10 м. Эффективность переноса эквивалентна или лучше, чем у традиционных методов вестерн-блоттинга.
Особый интерес представляют эффективные 10-метровые переносы mTOR и Ecm29, высокомолекулярных белков приблизительно 298 кДа и 205 кДа, соответственно, с помощью быстрого блоттера Pierce ™ G2. Как правило, высокомолекулярные белки трудно переносить, даже используя традиционные танковые методы. Мы обнаружили, что белки до 300 кДа хорошо переносятся через 10 м, используя быстрый блоттер Pierce ™ G2 и одноступенчатый буфер передачи Pierce ™ (данные не показаны).
Быстрый блоттер Thermo Scientific ™ Pierce ™ G2 быстро переносит широкий спектр белков молекулярной массы на мембрану с такой же или лучшей эффективностью, чем традиционные методы переноса, такие как резервуар и полусухое, а также другие системы быстрого блоттинга.
Заключение
Электроблоттинг белков - это распространенный метод переноса белков из полиакриламидного геля на мембрану для последующего вестерн-блоттинга.
Устаревший способ переноса белков на мембрану, предполагает размещение мембраны поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, унося с собой белки. На практике этот метод не используется, так как он занимает слишком много времени, электроблоттинг является предпочтительным.
Основными преимуществами электроблоттинга являются скорость и полнота передачи. В данном методе использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Мембраны используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано на гидрофобных взаимодействиях, а так же на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком. Передача может выполняться как во влажных, так и в полусухих условиях. Полусухой блоттинг быстрее и проще, и требует намного меньше объема буфера, чем влажный блоттинг.
Эффективность электроблоттинга значительно повышается при использовании системы Trans-Blot Turbo, позволяющей существенно уменьшить время переноса белков из геля на мембрану. Также к преимуществам данной системы относится высокая производительность, прибор состоит из двух кассет с независимым управлением, что позволяет запускать два разных протокола и проводить перенос до 4-х гелей одновременно.
Эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassie blue или Ponceau S. Предпочтительно используется краситель Ponceau S, который обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение антител.
Литература
1. Биотехнология / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М.: Наука, 2018. – 746 с.
1. Биотехнология: теория и практика / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. 2-е изд., – М.: Оникс, 2019. – 496 с.
2. Блинов, В.А. Общая биотехнология. / В.А. Блинов. – С.: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2017. – 162с.
3. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов. – С.: Гарнитура Таймс, 2018. – 102 с.
4. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа: http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv
5. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2017. – 506 с.
6. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. / Н.А. Кузьмина. – О.: Электронное издание, 2019.
8. Орехов, С.Н. Биотехнология / С.Н. Орехов. – М.: Электронное издание, 2018.
9. Сазыкин Ю.О. Биотехнология. /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Академия, 2018. – 256 с
2
1. Биотехнология / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М.: Наука, 2018. – 746 с.
1. Биотехнология: теория и практика / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. 2-е изд., – М.: Оникс, 2019. – 496 с.
2. Блинов, В.А. Общая биотехнология. / В.А. Блинов. – С.: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2017. – 162с.
3. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов. – С.: Гарнитура Таймс, 2018. – 102 с.
4. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа: http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv
5. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2017. – 506 с.
6. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. / Н.А. Кузьмина. – О.: Электронное издание, 2019.
8. Орехов, С.Н. Биотехнология / С.Н. Орехов. – М.: Электронное издание, 2018.
9. Сазыкин Ю.О. Биотехнология. /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Академия, 2018. – 256 с
Вопрос-ответ:
Что такое электроблоттинг белков?
Электроблоттинг белков - это метод, используемый в биохимических исследованиях, который позволяет разделить и определить белки в образцах тканей или клеток. Он основан на использовании электрического поля для переноса белков на мембрану из полиакриламидного геля, где они могут быть обнаружены и проанализированы с помощью различных методов обнаружения.
Как работает метод переноса белков на мембрану электроблоттинг?
Метод переноса белков на мембрану электроблоттинг основан на создании электрического поля, которое помогает перенести белки с геля на мембрану. Сначала гель с белками помещается между электрода и на него накладывается мембрана. Затем включается источник постоянного тока, который создает электрическое поле. Белки с полиакриламидного геля переносятся на мембрану под воздействием электрического поля и фиксируются на ней, где их можно обнаружить и проанализировать.
Сколько времени занимает перенос белка с использованием экспресс блоттинга?
Перенос белка с использованием экспресс блоттинга, такого как Pierce G2, может занять всего 5-10 минут. Этот метод эффективен и быстр, и позволяет достигнуть высокой эффективности переноса белков на мембрану. Он является более быстрым альтернативой традиционным методам, как резервуарный метод и полусухой метод.
Как сравнивается эффективность переноса белков экспресс блоттингом и традиционными методами?
Экспресс блоттинг, такой как Pierce G2, обеспечивает сопоставимую эффективность переноса белков с традиционными методами, такими как резервуарный метод и полусухой метод. Это быстрый и удобный метод, который может использоваться для исследования белков в различных образцах, таких как лизаты клеток или тканей.
Как можно получить лизат HeLa с использованием азотной кавитации?
Для получения лизата HeLa с использованием азотной кавитации, первоначально клетки HeLa подвергаются азотной кавитации в специальном оборудовании. Это позволяет разрушить клеточные структуры и получить лизат, содержащий различные белки. Полученный лизат можно использовать для последующего анализа методом электроблоттинга или другими методами биохимического исследования.
Что такое электроблоттинг белков?
Электроблоттинг белков - это метод, который используется для переноса белков с геля на мембрану с целью их обнаружения и анализа.
Как происходит метод переноса белков на мембрану электроблоттинг?
Метод переноса белков на мембрану электроблоттинг основан на применении электрического поля, которое помогает белкам передвигаться через гель и фиксируется на мембране.
Каким образом можно увеличить эффективность переноса белков с помощью электроблоттинга?
Увеличить эффективность переноса белков можно путем увеличения тока в 10 и более раз по всей поверхности сэндвича, что позволит достичь эквивалентной эффективности методам резервуара и полусухого всего за 5-10 минут.
Какой метод переноса белка эффективнее: экспресс блоттинг или традиционный танковый метод?
По сравнению с традиционным танковым методом, перенос белка с использованием экспресс блоттинга Pierce G2 обладает большей эффективностью. Например, для лизата HeLa в концентрации 3,0 мг/мл, полученного азотной кавитацией, экспресс блоттинг методом Pierce G2 может быть использован для достижения более быстрого и точного результата.
Какие преимущества имеет метод электроблоттинга белков?
Метод электроблоттинга белков имеет несколько преимуществ, таких как возможность обнаружения редких и маломолекулярных белков, удобство и скорость проведения эксперимента, возможность использования различных типов мембран для фиксации белков и сохранение их структуры и функции в процессе переноса.