Структура и механизм флуоресценции белка GFP и его практическое использование.

Таким образом, метки слияния GFP могут быть использованы для визуализации динамических клеточных событий и мониторинга локализации белка. GFP идеально подходит в качестве флуоресцентного маркера, поскольку не требует присутствия каких-либо кофакторов или субстратов. Хромофор производится invivo, и в большинстве случаев полученная химера не влияет на локализацию или активность меченого белка. По этой причине белки слияния GFP являются наиболее распространенным и успешным применением GFP в биотехнологии. GFP как маркер токсичности: благодаря тому, что интенсивность флуоресценции GFP уменьшается с увеличением токсичности, его можно использовать в качестве маркера токсичности окружающей среды. GFP может быть добавлен в организмы-хозяева без отрицательного эффекта, а затем его интенсивность отслеживается в различных средах у разных организмов.GFP в изучении наследственности: если в геном организма встроен GFP, то GFP естественным образом передается потомству без каких-либо дополнительных процессов, что позволяет использовать неинвазивные способы введения флуоресцентного маркера и отслеживать его в разных поколениях животных или клеток. GFP не вмешивается ни в какие биологические процессы. Трансгенные мыши могут быть помечены GFP, который затем легко обнаружить в их потомстве, подвергнув их воздействию синего или ультрафиолетового света.GFP можно соединять с другими белками, эффективно делая эти белки флуоресцентными. Это можно сделать с помощью специальных линкеров, чтобы GFP не влиял на функцию интересующего белка и мог диффундировать через клетки. Это позволяет локализовать и отслеживать любой белок с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии: воздействуя на клетки синим светом, интересующий белок будет флуоресцировать зеленым светом.GFP в экспериментах с живыми клетками: классической зеленой флуоресцентной молекулой является изотиоцианатфлуоресцеина (FITC), но он токсичен для клеток и не может быть использован напрямую без предварительной фиксации клеток или нанесения повреждений. GFP гораздо менее вреден, поскольку он является белком естественного происхождения и может использоваться в экспериментах на живых клетках, не причиняя практически никакого вреда, особенно если он передается потомству.GFP в передовых методах микроскопии: несколько методов флуоресцентной микроскопии, таких как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET), были разработаны с использованием GFP, что позволяет исследователям использовать все более специфические и мощные методыфлуоресценции для визуализации.За последние несколько лет было клонировано множество GFP-подобных белков и сегодня в различных лабораториях мира целенаправленно развиваются или находятся все новые их свойства. Благодаря некоторым из недавних разработок сегодня арсенал биотехнологии пополняется новыми мощными инструментами, позволяющими прицельно вводить флуоресцентный сигнал в выбранную живую клетку или ее область, и затем отслеживать перемещение фотомеченных белков, органелл и клеток. Активность исследователей в этой области позволяет рассчитывать, что в ближайшие несколько лет эти новые инструменты будут доведены если не до совершенства, то до высокого уровня, который позволит шагнуть вперед в исследовании как внутриклеточных процессов, так и процессов, связанных с миграцией клеток в живых тканях.Таким образом, GFP является фундаментальной частью флуоресцентной микроскопии благодаря простоте использования, а возможности применения ограничены только воображением исследователя. Постоянное совершенствование GFP со временем привело к тому, что флуоресцентная микроскопия и исследования продвигаются вперед благодаря гибкой природе GFP и большому количеству исследований, основанных на использовании GFP и его многочисленных вариантов.Список литературыGerdes, H. H., & Kaether, C. (1996). Green fluorescent protein: applications in cell biology. FEBS letters, 389(1), 44-47.Yang, F., Moss, L. G., & Phillips, G. N. (1996). The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology, 14(10), 1246–1251. doi:10.1038/nbt1096-1246 Youvan, D. C., & Michel-Beyerle, M. E. (1996). Structure and fluorescence mechanism of GFP. Nature Biotechnology, 14(10), 1219–1220. doi:10.1038/nbt1096-1219 Zimmer, M. (2002). Green Fluorescent Protein (GFP):  Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior. Chemical Reviews, 102(3), 759–782. doi:10.1021/cr010142r Степаненко, О. В., Верхуша, В. В., Кузнецова, И. М., & Туроверов, К. К. (2007). Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология, 49(5), 395-420.Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов для изучения подвижности белков invivo / БИОХИМИЯ, 2003, том 68, вып. 9, с. 1166–1172