Выделение и очистка ферментов

Другой вариант - гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография. Этим методом можно разделить белки, отличающиеся по размеру (молекулярной массе). Крупные белки элюируются быстрее, а мелкие - задерживаются в порах сорбента и десорбируются позже. Очень перспективна аффинная хроматография, основанная на специфичном связывании фермента с рецептором или аналогом субстрата. Методом аффинной хроматографии проводят очистку генноинженерных ферментов. Так Ni-содержащие аффинные сорбенты используют для очистки ферментов со специальными «хвостами» из 6-10 остатков гистидина. Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение молекул белков по их заряду в электрическом поле [8].Ферменты при достаточной степени очистки можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжается увеличение активности фермента.Концентрирование водных ферментных растворов и получение сухих препаратов ферментов проводят методом лиофильной (сублимационной) сушки в вакууме. Следует отметить, что упаривание воды неприменимо для растворов ферментов, так как ферменты, как правило, термолабильны. Раствор быстро замораживают в жидком азоте и подключают к вакуумной системе. В этих условиях происходит сублимация воды - переход кристаллической воды в газ. Такие лиофильно высушенные препараты достаточно стабильны [5].Примеры выделения и очистки ферментов из исследованийВ исследовании Епринцева и Гатауллиной (2018) производили выделение и очистку пероксисомальноймалатдегидрогеназы из мезофилла листьев кукурузы. Пероксисомальнаямалатдегидрогеназа из мезофилла листьев кукурузы была очищена до гомогенного состояния с использованием схемы очистки, включающей центрифугирование в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Получен фермент с удельной активностью 533 Е/мг белка со степенью очистки 144 и выходом 5%. Определены константы Михаэлиса для прямой и обратной реакций,равные 11.6 мМ и 256 мкМ, и pH оптимум действия 9.5 и 9.0 соответственно. Анализ значений молекулярной массы нативного фермента и его субъединиц показал, что пероксисомальнаямалатдегидрогеназа представляла собой гомодимер. Установлено, что выделенная и очищенная изоформафермента обладала более высоким сродством к малату и НАД+ по сравнению с митохондриальнойи цитоплазматической изоформами [4].В работе Джакашевой с соавт. (2016) производилось выделение и очистка пектиназыAspergillusawamori. Технологически проработан и апробирован сорбционный метод очистки и выделения пектолитического ферментного препарата из культуральной жидкости штамма A. awamori 56-2-53-85-375, полученного в результате многоступенчатой селекции. Адсорбционная очистка с помощью микропористого активированного угля марки КАД-Г позволяет проводить очистку и выделение пектиназ при минимальном снижении общей активности ферментных растворов. При дозировке сорбента 10 г/л достигается степень очистки по цветности 63%, удельная активность пектиназы увеличивается до 97,5% при потере активности 4,8%.Обесцвечивание пектолитических ферментных растворов и удаление низкомолекулярных неактивных примесей делает возможным его использование на начальном этапе очистки[2].В исследовании Закирова и Равшанова (2021) приведены результаты исследований по разработке оптимальных условий выделения инулиназы из клубней топинамбура (Helianthustuberosus). Выявлен наиболее эффективный экстрагент, способствующий максимальному переходу белков в раствор, осуществлено концентрирование экстракта растворимого белка с полным сохранением его ферментативной активности. При мацерации кислород мезги вытесняется газом СО2. Данное направление исследования клеточных инулиназ является весьма актуальным при переработке клубней на сиропы, функциональные пищевые продукты, биологически активные добавки и при производстве кристаллической фруктозы из местных сортов топинамбура.Список литературыВарфоломеев, С. Д. (2005). Химическая энзимология.Джакашева, М. А., Кедельбаев, Б. Ш., & Питер, Л. (2016). Выделение и очистка пектиназыAspergillusawamori. Образовательный вестник «Сознание», 18(11), 32-35.Дытнерский Ю. И., Мембранные процессы разделения жидких смесей, М., 1975.Епринцев, А. Т., & Гатауллина, М. О. (2018). Выделение и очистка пероксисомальноймалатдегидрогеназы из мезофилла листьев кукурузы и ее характеристика. Прикладная биохимия и микробиология, 54(3), 299-303.Заболоцкая, Е. Р., & Сазанов, А. А. (2018). Современные методы выделения и очистки ферментов. Ветеринария, зоотехния и биотехнология, (12), 106-111.Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ.: — М.: Мир, 1993. - 384 с.Нельсон, Д., & Кокс, М. (2017). Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т. 1. Основы биохимии. Строение и катализ. М.: Лаборатория знаний.Северин, С. Е., Алейникова, Т. Л., Осипов, Е. В., & Силаева, С. А. (2017). Биологическая химия.