Питательные среды и их модификации для микроклонального размножения крупнокосточковых культур (персик, абрикос, слива)

В этом эксперименте первичные экспланты (активно растущие верхушки побегов и вегетативные почки), выделенные из инфицированных растений персика, вносили после добавления вирусного агента в улучшенную синтетическую питательную среду. Эксперименты с саженцами персика, зараженными вирусом некротической кольцевой гнили, показали хорошие результаты при концентрации HEO-DHT 85 мг/л. Оптимальная концентрация рибавирина, при которой микробы росли нормально и без вирусной инфекции, составляла 5 мг/л. Увеличение концентрации рибавирина значительно снизило рост микробов, обводненность и смертность. Чтобы устранить крайнее доминирование и вызвать образование нескольких побегов, был протестирован регулятор роста БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л.
Под действием БАП рост придаточных почек и рост побегов у персика были разными. В обоих случаях коэффициент размножения увеличивался и достигал максимального значения на 4-м проходе.
4 Введение в культуру in vitro абрикоса

При введении в культуру in vitro абрикоса Prunus armeniaca L. показала, что инфекция в основном сосредоточена в опавших листьях и ниже чешуи почек. Лучшими побегами были побеги после эндогенного покоя и развившиеся из них микробласты в специфических растворах. Наиболее активное прорастание побегов после эндогенного покоя происходило в растворах следующего состава: 5 мг/л IPA (2-изопентениладенин), 4 мг/л HA (гибберелловая кислота), 10 мг/л AgNO3. Побеги, регенерированные с помощью этого состава, легко стерилизуются и имеют низкое содержание внутренних загрязнений. Меристемы, выделенные из растущих побегов, продолжали расти только в присутствии кондиционирующего агента - пептида глутатиона. Питательная среда «M2Ab» была разработана специально для роста меристем абрикоса (Таблица 1). Эта среда поддерживает до 80% жизнеспособных проросших меристем размером 0,1-0,3 мм. Меристемы образуют гетерогенный каллус с зонами морфогенеза. Морфогенетический каллус имеет ярко-зеленый или зеленоватый цвет. Морфогенетический каллус с микробластами переносят на среду (SCC1M) через 3-4 недели, чтобы инициировать образование множественных морфогенетических полос и придаточных почек. Для нормализации роста или перед фазой укоренения микробласты переносят на среду M2ABM.
Чередование сред CCK1M и M2ABM обеспечило хорошие темпы роста (3-7 побегов на делянку) и нормальный рост побегов с темно-зелеными листьями до 40 мм без высыхания или чрезмерного полива.
Регенерация микробластов из листовых черенков была достигнута путем индукции морфогенетических каллусов. Каллус с морфогенетическими полосами и эмбрионоподобными структурами индуцировали в темноте из протравленных листьев стебля, выращенных in vitro. Каждый лист протравливали три или четыре раза в боковом направлении, не удаляя черенки полностью. Листья выращивали в осевом направлении в контакте со средой.
Среда для инициации морфогенеза "E26" из листовых черенков содержала возрастающие концентрации сахарозы (3%), 1 мг/л тидиазурона и 0,3 мг/л NUC. После переноса морфогенетических структур на среду "SCC1M" и переноса культуры на свет, морфогенетическая зона становилась зеленой и формировала эмбриоидные структуры вместе с микробластами. Затем придаточные почки, микробласты и эмбриоидные структуры переносили на среду «M2ABM» для роста микробластов или на среду «CCK1M» для дальнейшего размножения. Попытки регенерировать растения непосредственно из эмбриоидных структур не предпринимались.
Было проведено экспериментальное укоренение микроспор абрикоса in vitro и in vivo. Состав наиболее удачного раствора для укоренения абрикоса содержал ингибиторы оксидазы КМП: кофейную и феруловую кислоты, а также ауксин. Побеги высотой 25-40 мм помещали в колбы или пробирки в среду для укоренения "2U65M2" и инкубировали в темноте в течение 7 дней при температуре 18-22˚C с 16-часовым периодом облучения.
Второй метод укоренения проводился в виде зеленых черенков, т.е. побеги, достигшие 25-40 мм в питательной среде, отделялись от морфогенетической зоны пластинкой и инкубировались в смеси ауксина 50 мг/л ИМК, 50 мг/л феруловой кислоты и 25 мг/л кофейной кислоты в течение 8 ч в темноте. Обработанные микрочеренки абрикоса были помещены в кассеты, содержащие смесь стерильного перлита, песка и торфа (2:1: 1) и инкубировали в микротермической теплице при температуре 18-22˚C и световом периоде 16 ч; через 1 месяц черенки были перенесены в горшки объемом 0,5 л, содержащие смесь торфа, нейтрального верхнего слоя почвы, перлита и речного песка в соотношении 1:1:2:2. Проращивание проводилось при температуре 22-24˚C и 16-часовом фотопериоде в стерильных условиях.
Хотя это только первый эксперимент по укоренению абрикоса in vitro, он показывает, что использование растворов ауксина с ингибиторами IUK-оксидазы является перспективным. Выход саженцев в горшках не превышал 10-15% при использовании любого из двух методов укоренения. В предыдущих опытах с черенками абрикоса с использованием того же состава выход укорененных саженцев составлял 30-35%. Укорененные саженцы Рубина Саратовского, выращенные в почве, зацвели на третий год и показали незначительную урожайность на пятый год.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день самым надежным способом получения генетически идентичного потомства считается микроклональное размножение плодовых косточковых культур пазушными почками по сравнению с соматическим эмбриогенезом, размножением адвентивными почками и непрямым морфогенезом.


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Высоцкий В. А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 5. С. 57–63. 2. Мартынов С.А., Митрофанова О.В. Биотехнологические приемы микроразмножения персика (Prunus persica (L. ) Batsch) в условиях in vitro // Бюллетень ГНБС. 2011. №103. 3. Трушечкин В. Г, Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Микроклональное размножение сортов и подвоев косточковых культур: Методические указания. М., 1983. С. 16. 4. Хаак Э. Р., Нууст Ю. О. Клональное микроразмножение косточковых культур // Садоводство и виноградарство. М., 1989. № 1. С. 27–29. 5. Роговая Вероника Валерьевна, Гвоздев Михаил Александрович Особенности микроклонального размножения косточковых культур в условиях in vitro // Известия РГПУ им. А. И. Герцена. 2005. №13. 6. Голубев Александр Михайлович Клональное микроразмножение некоторых генотипов абрикоса в культуре апикальных меристем и высечек листьев // Биология растений и садоводство: теория, инновации. 2017. №144-2. 7. Голубев Александр Михайлович, Бодров Н.В., Анфалов Владимир Эдуардович, Алешина Наталья Александровна Научно-методические подходы в создании генофонда косточковых культур // Вестник КрасГАУ. 2020. №7. 8. Шоферистов Евгений Петрович, Цюпка Сергей Юрьевич Генетические основы селекции косточковых плодовых растений // Биология растений и садоводство: теория, инновации. 2019. №152. 9. Острикова О.В., Федотова И.Э., Хархардина Е.Л. Влияние условий культивирования на эффективность первого этапа клонального микроразмножения сортов абрикоса обыкновенного // СССК. 2019. №2. 10. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Adventitious shoot regeneration in peach [Prunus persica (L.) Batsch] // Plant Cell Reports. 2002. Vol. 20. P. 1011–1016.











2