Секвенирование второго поколения в анализе структуры и экспрессии малых РНК

Для этого применяются статистические методы, описанные в предыдущих разделах.В заключение, оценка представленности транскриптов, в том числе микроРНК, является важным компонентом анализа данных секвенирования. Использование различных показателей, таких как TPM и FPKM, а также вероятностных моделей, позволяет получать более точные и достоверные оценки экспрессии. Учет факторов, влияющих на точность количественных измерений, и интеграция с процессом аннотации транскриптома являются ключевыми для получения надежных результатов.5.5 Анализ дифференциальной экспрессии транскриптовОдной из ключевых задач в исследованиях, связанных с микроРНК, является выявление дифференциально экспрессируемыхтранскриптов между различными биологическими условиями или группами образцов. Анализ дифференциальной экспрессии позволяет идентифицировать микроРНК, которые могут играть важную роль в регуляции биологических процессов и развитии заболеваний.Для проведения анализа дифференциальной экспрессии транскриптов, включая микроРНК, широко используются данные секвенирования нового поколения (NGS). Эти технологии позволяют получать количественные оценки экспрессии большого числа транскриптов одновременно, что создает основу для статистического сравнения их представленности между группами образцов.Существует множество подходов и инструментов, применяемых для выявления дифференциально экспрессируемыхмикроРНК. Одним из наиболее распространенных методов является использование моделей, основанных на отрицательном биномиальном распределении, таких как DESeq2 и EdgeR. Эти алгоритмы учитывают как биологическую, так и техническую вариабельность данных NGS, что повышает точность результатов.Другим широко используемым подходом является применение линейных моделей, реализованных в инструментах, например, limma-voom. Этот метод позволяет более гибко моделировать сложные экспериментальные дизайны и учитывать различные ковариаты, влияющие на экспрессию микроРНК.Существуют и более универсальные инструменты, такие как Sleuth, которые могут работать с различными типами распределений count-данных и обеспечивают более высокую чувствительность при небольших размерах выборки.Важным шагом является визуализация и интерпретация результатов дифференциальной экспрессии. Методы кластеризации, такие как иерархическая кластеризация или t-SNE, позволяют наглядно представить различия в профилях экспрессии микроРНКмежду группами образцов, что помогает выявить ключевые микроРНК, ответственные за наблюдаемые различия.Для интерпретации биологического смысла дифференциально экспрессируемыхмикроРНК используются методы функционального анализа. Например, определение обогащенных биологических путей, сетевой анализ или предсказание мишеней микроРНК дают возможность связать изменения в экспрессии с конкретными клеточными процессами и механизмами.Следует отметить, что анализ дифференциальной экспрессии микроРНК сталкивается с рядом ограничений и особенностей. Например, высокая степень гомологии между некоторыми микроРНК может затруднять их корректное сопоставление и количественную оценку. Кроме того, наличие изоформ и модификаций микроРНК также может влиять на достоверность результатов.В заключение, анализ дифференциальной экспрессии транскриптов, включая микроРНК, является ключевым этапом в исследованиях, связанных с этими регуляторными молекулами.ЗаключениеСеквенирование нового поколения (NGS) стало незаменимым инструментом для всестороннего анализа малых РНК, в том числе микроРНК. Эти технологии позволяют получать высокопроизводительные данные о структуре и экспрессии широкого спектра малых регуляторных РНК, открывая новые возможности для понимания их роли в биологических процессах и развитии заболеваний.В ходе данного обзора были рассмотрены ключевые этапы и методы, используемые при анализе малых РНК с помощью платформ NGS. Начиная с выделения высококачественных препаратов микроРНК и заканчивая статистической обработкой и интерпретацией полученных данных, каждый шаг этого процесса требует тщательной оптимизации и контроля качества.Были описаны различные подходы к пробоподготовке, включая методы фрагментации, лигирования адаптеров и обратной транскрипции, которые позволяют создавать репрезентативные библиотеки малых РНК. Кроме того, рассмотрены основные платформы секвенирования второго поколения, такие как Illumina, IonTorrent, PacBio и OxfordNanopore, каждая из которых имеет свои преимущества и области применения.Важным аспектом анализа малых РНК является выравнивание секвенированныхридов на референсныйтранскриптом и аннотация идентифицированных последовательностей. Использование специализированных биоинформатических инструментов, учитывающих особенности структуры и модификаций малых РНК, позволяет повысить точность этих процессов.Одной из ключевых задач в исследованиях малых РНК является сравнение их экспрессии между различными биологическими условиями. Были рассмотрены статистические методы, основанные на моделировании count-данных, которые позволяют выявлять дифференциально экспрессируемые малые РНК с учетом биологической и технической вариабельности.Были освещены подходы к количественной оценке представленности малых РНК, включая использование показателей TPM и FPKM, а также более сложных вероятностных моделей. Эти методы играют важную роль в интерпретации профилей экспрессии малых РНК.В заключение, обзор продемонстрировал, что анализ малых РНК с помощью секвенирования нового поколения является мощным инструментом, открывающим новые горизонты в исследованиях регуляторных механизмов, связанных с этими молекулами. Дальнейшее развитие методов пробоподготовки, секвенирования и биоинформатической обработки данных будет способствовать более глубокому пониманию функций малых РНК в биологических системах и их потенциального применения в клинической практике.Список литературыБородинов, А.Г. Поколения методов секвенирования ДНК (обзор) / А.Г. Бородинов, В.В. Манойлов, И.В. Заруцкий, А.И. Петров, В.Е. Курочкин // Научное приборостроение. – 2020. – Т. 30, № 4. – С. 3-20.Ambros, V. The functions of animal microRNAs / V. Ambros // Nature. – 2004. – Vol. 431, № 7006. – P. 350-355.Auer, P. L. Statistical design and analysis of RNA sequencing data / P. L. Auer, R. W. Doerge // Genetics. – 2010. – Vol. 185, № 2. – P. 405-416.Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function / D. P. Bartel // Cell. – 2004. – Vol. 116, № 2. – P. 281-297.Becker, C. mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis / C. Becker, A. Hammerle-Fickinger, I. Riedmaier, M. W. Pfaffl // Methods. – 2010. – Vol. 50, № 4. – P. 237-243.Benesova, S.; Kubista, M.; Valihrach, L. Small RNA-Sequencing: Approaches and Considerations for miRNA Analysis. Diagnostics 2021, 11, 964.Benjamini, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing / Y. Benjamini, Y. Hochberg // Journal of the Royal statistical society: series B (Methodological). – 1995. – Vol. 57, № 1. – P. 289-300.Bray, N. L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification / N. L. Bray, H. Pimentel, P. Melsted, L. Pachter // Nature biotechnology. – 2016. – Vol. 34, № 5. – P. 525-527.Bullard, J. H. Evaluation of statistical methods for normalization and differential expression in mRNA-Seq experiments / J. H. Bullard, E. Purdom, K. D. Hansen, S. Dudoit // BMC bioinformatics. – 2010. – Vol. 11, № 1. – P. 1-13.Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments / S. A. Bustin, V. Benes, J. A. Garson, J. Hellemans, J. Huggett, M. Kubista, R. Mueller, T. Nolan, M. W. Pfaffl, G. L. Shipley, J. Vandesompele, C. T. Wittwer // Clinical chemistry. – 2009. – Vol. 55, № 4. – P. 611-622.Chen, C. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR / C. Chen, D. A. Ridzon, A. J. Broomer, Z. Zhou, D. H. Lee, J. T. Nguyen, M. Barbisin, N. L. Xu, V. R. Mahuvakar, M. R. Andersen, K. Q. Lao, K. J. Livak, K. J. Guegler // Nucleic acids research. – 2005. – Vol. 33, № 20. – P. e179-e179.Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Analytical biochemistry. – 1987. – Vol. 162, № 1. – P. 156-159.Dard-Dascot, C., Naquin, D., d’Aubenton-Carafa, Y. et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics 19, 118 (2018). Eid, J. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules / J. Eid // Science. – 2009. – Vol. 323, № 5910. – P. 133-138.Fang, X. Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine: a chemical biology approach / X. Fang, W. Tan // Accounts of chemical research. – 2010. – Vol. 43, № 1. – P. 48-57.Faridani, O. R. Single-cell sequencing of the small-RNA transcriptome / O. R. Faridani, I. Abdullayev, M. Hagemann-Jensen, J. P. Schell, F. Lanner, R. Sandberg // Nature biotechnology. – 2016. – Vol. 34, № 12. – P. 1264-1266.Frankish, A. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes / A. Frankish, M. Diekhans, A. M. Ferreira, R. Johnson, I. Jungreis, J. Loveland, J. M. Mudge, C. Sisu, J. Wright, J. Armstrong, I. Barnes, A. Berry, A. Bignell, S. Carbonell Sala, J. Chrast, F. Cunningham, T. Di Domenico, S. Donaldson, I. T. Fiddes, C. GarcíaGirón, J. M. Gonzalez, T. Grego, M. Hardy, T. Hourlier, T. Hunt, O. G. Izuogu, D. Lagarde, F. J. Martin, L. Martínez, S. Mohanan, P. Muir, F. C. P. Navarro, A. Oktaba, A. Pagès, A. Ballesteros Pérez, K. Ruffier, M. Schmitt, E. Spannagl, V. Stapleton, M. Suner, I. Thieme, M. L. Tress, J. L. Uszczynska-Ratajczak, S. J. Xu, A. Yates, D. Zerbino, Y. Zhang, B. Aken, E. Choudhary, R. Aken, J. Harrow, P. Flicek // Nucleic acids research. – 2019. – Vol. 47, № D1. – P. D766-D773.Friedländer, M. R. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades / M. R. Friedländer, S. D. Mackowiak, N. Li, W. Chen, N. Rajewsky // Nucleic acids research. – 2012. – Vol. 40, № 1. – P. 37-52.Fromm, B. A uniform system for the annotation of vertebrate microRNA genes and the evolution of the human microRNAome / B. Fromm, T. Billipp, L. E. Peck, M. Johansen, J. E. Tarver, B. L. King, K. J. Newcomb, D. E. Sempere, P. Flatmark, A. J. Bassett, J. L. Alkeskas, S. A. Dinsdale, G. Raison, S. Aena, M. E. Grimes, G. Martins, J. C. Oliveira, A. L. Kuhn, T. Schwager, R. Buß, S. Bullerdiek, A. Semon, A. Drenkow, P. Alvarado, S. Bernal, E. Kohl, B. Chelliah, E. Fiedler, J. Keller, M. Guettouche, J. Blanchet, F. Faber, M. Menzel, M. Teubner, T. Petersen, R. Roos, D. Sefler, M. Kottmann, M. Schroeder, D. Ritter, P. Schreiner, M. Keller, P. Eckhard, K. J. Peterson // Annual review of genetics. – 2015. – Vol. 49. – P. 213-242.Garalde, D. R. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores / D. R. Garalde, E. A. Snell, D. Jachimowicz, B. Sipos, J. H. Lloyd, M. Bruce, N. Pantic, T. Admassu, P. James, A. Warland, M. Jordan, J. Ciccone, S. Serra, J. Keenan, S. Martin, L. McNeill, E. J. Wallace, L. Jayasinghe, C. Wright, J. Blasco, S. Young, D. Brocklebank, S. Juul, J. Clarke, A. J. Heron, D. J. Turner // Nature methods. – 2018. – Vol. 15, № 3. – P. 201-206.Gorgannezhad, L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies / L. Gorgannezhad, M. Umer, M. N. Islam, N. T. Nguyen, M. J. A. Shiddiky // Lab on a Chip. – 2018. – Vol. 18, № 8. – P. 1174-1196.Hackenberg, M. miRanalyzer: an update on the detection and analysis of microRNAs in high-throughput sequencing experiments / M. Hackenberg, N. Rodríguez-Ezpeleta, A. M. Aransay // Nucleic acids research. – 2011. – Vol. 39, suppl_2. – P. W132-W138.Hafner, M. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries / M. Hafner, N. Renwick, M. Brown, A. Mihailović, D. Holoch, C. Lin, J. T. Pena, J. D. Nusbaum, P. Morozov, J. Ludwig, T. Ojo, S. Luo, G. Schroth, T. Tuschl // RNA. – 2011. – Vol. 17, № 9. – P. 1697-1712.ISO/TS 20395:2019. Biotechnology - Requirements and guidelines for microRNA qPCR experiments.Jones, L. J. RNA quantitation by fluorescence-based solution assay: RiboGreen reagent characterization / L. J. Jones, S. T. Yue, C. Y. Cheung, V. L. Singer // Analytical biochemistry. – 1998. – Vol. 265, № 2. – P. 368-374.Kozomara, A. miRBase: from microRNA sequences to function / A. Kozomara, M. Birgaoanu, S. Griffiths-Jones // Nucleic acids research. – 2019. – Vol. 47, № D1. – P. D155-D162.Kroh, E. M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) / E. M. Kroh, R. K. Parkin, P. S. Mitchell, M. Tewari // Methods. – 2010. – Vol. 50, № 4. – P. 298-301.Langmead, B. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome / B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S. L. Salzberg // Genome biology. – 2009. – Vol. 10, № 3. – P. R25.Love, M. I. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 / M. I. Love, W. Huber, S. Anders // Genome biology. – 2014. – Vol. 15, № 12. – P. 1-21.Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation / M. L. Metzker // Nature reviews genetics. – 2010. – Vol. 11, № 1. – P. 31-46.Minoche, A. E. Evaluation of genomic high-throughput sequencing data generated on Illumina HiSeq and genome analyzer systems / A. E. Minoche, J. C. Dohm, H. Himmelbauer // Genome biology. – 2011. – Vol. 12, № 11. – P. 1-17.Mraz, M. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples / M. Mraz, K. Malinova, J. Mayer, S. Pospisilova // Biochemical and biophysical research communications. – 2009. – Vol. 390, № 1. – P. 1-4.Nawrocki, E. P. Rfam 12.0: updates to the RNA families database / E. P. Nawrocki, S. W. Burge, A. Bateman, J. Daub, R. Y. Eberhardt, S. R. Eddy, E. W. Floden, P. P. Gardner, T. A. Jones, J. Tate, M. M. Finn // Nucleic acids research. – 2015. – Vol. 43, № D1. – P. D130-D137.Neilsen, C. T. IsomiRs--the overlooked repertoire in the dynamic microRNAome / C. T. Neilsen, G. J. Goodall, C. P. Bracken // Trends in genetics. – 2012. – Vol. 28, № 11. – P. 544-549.Ozsolak, F. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities / F. Ozsolak, P. M. Milos // Nature reviews genetics. – 2011. – Vol. 12, № 2. – P. 87-98.Pimentel, H. Differential analysis of RNA-seq incorporating quantification uncertainty / H. Pimentel, N. L. Bray, S. Puente, P. Melsted, L. Pachter // Nature methods. – 2017. – Vol. 14, № 7. – P. 687-690.Pritchard, C. C. MicroRNA profiling: approaches and considerations / C. C. Pritchard, H. H. Cheng, M. Tewari // Nature reviews genetics. – 2012. – Vol. 13, № 5. – P. 358-369.Quail, M. A. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers / M. A. Quail, M. Smith, P. Coupland, T. D. Otto, S. R. Harris, T. R. Connor, A. Bertoni, H. P. Swerdlow, Y. Gu // BMC genomics. – 2012. – Vol. 13, № 1. – P. 1-13.Redshaw, N. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability / N. Redshaw, T. Wilkes, A. Whale, S. Cowen, J. Huggett, C. A. Foy // Biotechniques. – 2013. – Vol. 54, № 3. – P. 155-164.Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies / M. E. Ritchie, B. Phipson, D. Wu, Y. Hu, C. W. Law, W. Shi, G. K. Smyth // Nucleic acids research. – 2015. – Vol. 43, № 7. – P. e47-e47.Robinson, M. D. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data / M. D. Robinson, D. J. McCarthy, G. K. Smyth // Bioinformatics. – 2010. – Vol. 26, № 1. – P. 139-140.Rothberg, J. M. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J. M. Rothberg // Nature. – 2011. – Vol. 475, № 7356. – P. 348-352.Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D. W. Russell. – Cold Spring Harbor laboratory press, 2001.Sequencing Quality Control (SEQC) Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium / Sequencing Quality Control (SEQC) Consortium // Nature biotechnology. – 2014. – Vol. 32, № 9. – P. 903-914.Seyednasrollah, F. Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies / F. Seyednasrollah, A. Laiho, L. L. Elo // Briefings in bioinformatics. – 2015. – Vol. 16, № 1. – P. 59-68.Sorefan, K. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing / K. Sorefan, H. Pais, A. E. Hall, A. Kozomara, S. Griffiths-Jones, V. Moulton, T. Dalmay // Silence. – 2012. – Vol. 3, № 1. – P. 4.Trapnell, C. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks / C. Trapnell, A. Roberts, L. Goff, G. Pertea, D. Kim, D. R. Kelley, H. Pimentel, S. L. Salzberg, J. L. Rinn, L. Pachter // Nature protocols. – 2012. – Vol. 7, № 3. – P. 562-578.Vlachos, I. S. DIANA-miRPath v3.0: deciphering microRNA function with experimental support / I. S. Vlachos, K. Zagganas, M. D. Paraskevopoulou, G. Georgakilas, D. Karagkouni, T. Vergoulis, T. Dalamagas, A. G. Hatzigeorgiou // Nucleic acids research. – 2015. – Vol. 43, № W1. – P. W460-W466.Wagner, G. P. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples / G. P. Wagner, K. Kin, V. J. Lynch // Theory in Biosciences. – 2012. – Vol. 131, № 4. – P. 281-285.Wang, Z. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics / Z. Wang, M. Gerstein, M. Snyder // Nature reviews genetics. – 2009. – Vol. 10, № 1. – P. 57-63.